田殿梅,張良,,盧中明,,秦輝,侯長軍,霍丹群
1(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶,400044)2(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州,646000)
獼猴桃又名陽桃、茅梨,果實(shí)中除了含有大量VC外,還含有糖、鈣、鎂、鐵、磷、有機(jī)酸以及多種氨基酸,是人們所喜愛的特色水果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國栽培獼猴桃面積已達(dá)4萬余公頃,年產(chǎn)量達(dá)到近9萬t。有關(guān)人士預(yù)測:我國現(xiàn)有的獼猴桃在全部進(jìn)入盛果期后,產(chǎn)量會(huì)超過目前的消費(fèi)需求。目前,獼猴桃的貯藏保鮮技術(shù)尚不完善,銷售方式以鮮果為主,造成大量鮮果積壓與腐爛,因此,對(duì)其進(jìn)行深加工是發(fā)展的必然趨勢。在釀酒方面,由于原料供應(yīng)充足,具有顯著的資源優(yōu)勢,有利于保護(hù)果農(nóng)的栽培積極性,帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。目前,我國在獼猴桃酒釀制過程中,缺乏獼猴桃酒專用菌種,使用的酵母基本是AADY活性酵母或是葡萄酒酵母,它不是獼猴桃釀酒的理想酵母,獼猴桃酒用酵母最好從成熟的獼猴桃果實(shí)上分離選育,性能可滿足發(fā)酵徹底、產(chǎn)香能力強(qiáng)、產(chǎn)酸能力適度、對(duì)酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)大等基本要求。本試驗(yàn)通過富集培養(yǎng)和劃線分離源自成熟獼猴桃果皮、果汁自然發(fā)酵液中的微生物,并進(jìn)行有效的分離篩選,通過穩(wěn)定性測試、發(fā)酵力測試、發(fā)酵及蒸餾結(jié)果分析,篩選出適合獼猴桃白蘭地的優(yōu)良釀酒酵母[1-4],并通過ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)域序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)篩選菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[5]。
獼猴桃,四川長青縣海沃特品種;葡萄糖、酵母膏、蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑),Amresco;安琪酵母,安琪酵母股份有限公司。
7890 A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;美國Agilent公司;BIO-RAD mylyder,PCR擴(kuò)增儀;SW-CG-1C超凈工作臺(tái),蘇凈安泰;LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠
1.2.1 培養(yǎng)基的配制
TTC下層培養(yǎng)基:葡萄糖10.1 g,蛋白胨2.0 g,酵母浸膏1.5 g,酸性磷酸鉀 1.0 g,硫酸鎂 0.4 g,檸檬酸 0.27 g,瓊脂 30.0 g,水 200 mL。
TTC上層培養(yǎng)基:TTC 0.05 g,葡萄糖0.5 g,瓊脂 1.5 g,水 100 mL。
YPD培養(yǎng)基:酵母膏10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉 20 g,加水至 1 000 mL。
1.2.2 酵母菌的分離
用腐爛獼猴桃的果皮及部分果肉加到新鮮獼猴桃汁中發(fā)酵后取發(fā)酵液25 mL,用無菌水稀釋至250 mL,通過梯度稀釋方法將稀釋液接種至TTC分離培養(yǎng)基中培養(yǎng),挑選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的紅色菌株[6],并通過劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離純化菌株,觀察單菌落的形態(tài)大小,將分離出的單菌落接種于YPD斜面試管中,28℃培養(yǎng)2 d,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 酵母菌的初篩
采用杜氏管發(fā)酵法,將10 mL獼猴桃汁加入試管中,滅菌冷卻后加入酵母菌,在相同的培養(yǎng)條件下,測定菌株產(chǎn)氣能力,初步比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力,篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。記錄產(chǎn)氣時(shí)間和產(chǎn)氣量,重復(fù)3次。活化條件:28℃條件下,10°Brix麥芽汁恒溫振蕩10 h:發(fā)酵條件:28℃條件下,獼猴桃汁靜止發(fā)酵 48 h;接種量:l×106CFU/mL[7]。
1.2.4 酵母菌的復(fù)篩
按1×106CFU/mL的接種量,將篩選出的各菌種分別接至500 mL成分調(diào)整后的獼猴桃果漿中20℃培養(yǎng),比較各酵母發(fā)酵力,以安琪釀酒酵母為對(duì)照菌株;待發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行初次蒸餾,蒸餾條件:過濾發(fā)酵產(chǎn)物,取濾液400 mL,添加蒸餾水400 mL,功率選擇600 W,截取濾液400 mL供分析檢測。按照GB15038—2005規(guī)定的方法對(duì)各酵母釀造酒液進(jìn)行理化測定[8]。獼猴桃果漿成分調(diào)整方法:用葡萄糖調(diào)整糖度至18%,用CaCO3調(diào)整果漿至pH3.6,SO2添加量為75 mg/L。
1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件
色譜柱條件:進(jìn)樣口溫度250℃,起始溫度50℃,保留3 min,以 5℃/min升至 220℃,保留 30 min,載氣 He,檢測器溫度250℃。質(zhì)譜條件:電離方式 EI,電離電壓70 eV,恒壓10 Pa,連接桿溫度280 ℃,進(jìn)樣口溫度為 250 ℃ 。[9]
1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定
將菌種接種到盛有 YPD固體培養(yǎng)基的平板中,28℃ 培養(yǎng)2~3 d后涂片,用美蘭對(duì)細(xì)胞染色后鏡檢,觀察其細(xì)胞形態(tài);將活化好的酵母在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上劃線,25℃ 培養(yǎng)3 d,鏡檢是否有子囊孢子。
1.3.2 分子生物學(xué)鑒定
1.3.2.1 基因組DAN提取
收集過夜培養(yǎng)的酵母細(xì)胞,在液氮中充分研磨后用4 mLDNA提取液溶解并轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌的離心管中,加入與離心管中DNA提取液等體積的氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1),劇烈振蕩后 13 000 r/min離心。取上清液用等體積氯仿-異戊醇重復(fù)處理1次。加入等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻后于-20℃下靜置15 min,13 000 r/min 離心 7 min。沉淀用 100 μL 70%無水乙醇各洗滌1次,真空抽干后加入50 μL無菌水,溶解后-20℃下保藏備用[10]。
1.3.2.2 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min,95℃變性1 min,55℃退火 1 min,72℃ 延伸 2 min,共循環(huán) 35次,最后72℃延伸10 min,4℃保存,PCR產(chǎn)物純化后測序。反應(yīng)體系(25 μL)為:模板 DNA 3 μL 引物ITS1(10 mol/L)和 ITS4(10 mol/L)各 1μL,dNTPs(2.5 mmol)1 μL ,buffer 2.5μL,Taq 酶1 μL,用滅菌的雙蒸水將體系補(bǔ)齊至25 μL。
1.3.2.3 克隆
對(duì)擴(kuò)增的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列進(jìn)行純化(按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行操作),然后與克隆質(zhì)粒PUM-T載體連接(參照產(chǎn)品說明書),4℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞后,涂于含有 Amp(100 μg/mL)、IPTG(0.5 mmol/L),X-gal(80 μg/mL)的LB平板上,倒置培養(yǎng)過夜。用滅菌牙簽挑取孵性克隆至5 mL的LB培養(yǎng)基(含5 μL 50 μg/mL Amp)中.37℃下200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。
1.3.2.4 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
將培養(yǎng)24 h的菌液送至華大基因有限公司進(jìn)行測序,得到菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段的原始序列。在Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫中對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì);為進(jìn)一步顯示供試菌株和已知酵母菌的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位,根據(jù)同源序列搜索結(jié)果,采用MEGA5.0軟件,Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進(jìn)行1 000次 Bootstrap 檢驗(yàn)[11]。
在TTC顯色平板上共選取紅色較深的菌落23株,酵母菌在含有杜氏小管的試管中20℃發(fā)酵48 h產(chǎn)氣能達(dá)到約等于杜氏小管滿體積的酵母菌有10株,說明這些酵母菌起酵能力比較強(qiáng),可能有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率,將這10株酵母菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)篩。杜氏小管產(chǎn)氣情況如表1所示。
表1 杜氏小管產(chǎn)氣情況
將初篩到的10株酵母菌及對(duì)照菌株安琪釀酒酵母分別接種到20°Brix的獼猴桃果漿中20℃發(fā)酵10 d,測定其殘?zhí)?、酒精度及總酸度,如?所示。
表2 酵母菌發(fā)酵性能情況
通過GC-MS[12]分析不同酵母釀造的白蘭地香氣成分得知,獼猴桃白蘭地酒中的非酒精揮發(fā)物,包括高級(jí)醇、酯類物質(zhì)、揮發(fā)酸、以及醛酮類物質(zhì)是主要的香氣成分。這四類物質(zhì)在獼猴桃白酒中的含量比較如圖1。
圖1 各株酵母產(chǎn)高級(jí)醇、酯、醛酮及酸類物質(zhì)能力比較
由圖1可以看出N5和N13酵母釀造的白蘭地產(chǎn)酯性能均較其他酵母優(yōu)秀,同時(shí)其刺激性香氣成分包括高級(jí)醇、醛酮類物質(zhì)及酸類物質(zhì)的含量較其他酵母釀造的白蘭地均處于較低的水平。
其中具體香氣成分中對(duì)獼猴桃白蘭地貢獻(xiàn)較大的主要有β-苯乙醇(PEA)、乙酸乙酯及丁酸乙酯,其中β苯乙醇(PEA)是一種帶有淡雅細(xì)膩玫瑰氣味的芳香醇;丁酸乙酯具有菠蘿芳香氣味;乙酸乙酯具有果香味。這些物質(zhì)在獼猴桃白蘭地中的含量比較如圖2。
由圖2可以看出各組酵母產(chǎn)β-苯乙醇的能力基本處于相同的水平,而N5產(chǎn)乙酸乙酯及丁酸乙酯的能力明顯優(yōu)于其他酵母,其中乙酸乙酯的含量為0.094 4 g/L,丁酸乙酯的含量為0.122 0 g/L;N13酵母發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯含量為0.150 g/L。
圖2 各株酵母產(chǎn)β-苯乙醇、丁酸乙酯及乙酸乙酯能力比較
N5和N13酵母菌在PDA平板上培養(yǎng)2 d后形成的菌落呈橢圓形或卵圓形,乳白色,表面隆起,邊緣整齊,表面光滑,無光澤,質(zhì)地粘稠,聞其有酒香味;菌體細(xì)胞呈卵圓形,細(xì)胞為兩端及多端出芽生殖(圖3)。
圖3 N5和N13酵母菌落形態(tài)及顯微照片
以ITS1和ITS4為引物通過酵母菌特異性PCR反應(yīng):擴(kuò)增得到ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段為單一條帶,大小長度約為760bp,擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象,結(jié)果見圖4。
圖4 N5與N13酵母ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果
對(duì)兩株菌株的ITS-5.8S-ITS2序列進(jìn)行分析,并將得到的序列與NCBI Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列搜索。比對(duì)結(jié)果顯示,這2株菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)的相似性均達(dá)到99%,利用 MEGA 5.0軟件,Neighbor Joining方法構(gòu)建兩株酵母與相關(guān)菌種的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行1000次的相似度重復(fù)計(jì)算(圖5):結(jié)果表明,N5酵母和N13酵母均能與FR751341.1 Hanseniaspora uvarum聚在一起,與其遺傳距離最近,并且置信度均達(dá)到97%。據(jù)此可以認(rèn)為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。
圖5 N5和N13酵母ITS1-5.8S-ITS2 rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹
本研究從腐爛的獼猴桃果實(shí)自然發(fā)酵液中成功分離得到2株釀造性能優(yōu)良的酵母菌株N5和N13,在接種量為1×106CFU/mL、初始糖度為 18°Brix、SO2濃度為75 mg/L、初始pH值為3.6、發(fā)酵溫度為20℃時(shí),發(fā)酵10天,經(jīng)過一次蒸餾后得到的白蘭地在酒精度、乙酸乙酯及丁酸乙酯的含量方面均明顯優(yōu)于安琪酵母在相同條件下的釀造產(chǎn)物。經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS1-5.8S-ITS2 rDNA分子生物學(xué)鑒定二者與葡萄汁漢遜酵母的相似度達(dá)到99%,通過構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹得知,二者與葡萄汁漢遜酵母屬于同種的置信度達(dá)到97%,據(jù)此可以認(rèn)為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。
[1]魏彥鋒,蔣錫龍,孫玉霞,等.果酒酵母分離選育的研究進(jìn)展[J].中外葡萄與葡萄酒,2008(6):66-69.
[2]趙芳.安琪牌葡萄灑活性干酵母在草莓酒釀造中的應(yīng)用[J].中國釀造,2008(13):70 -72.
[3]李靜.果酒釀造中優(yōu)良酵母菌株的篩選[J].釀酒,2008,35(2):63-65.
[4]趙祥杰,陳衛(wèi)東,劉學(xué)銘,等.果酒酵母選育研究進(jìn)展[J].釀酒,2006,33(1):57 -59.
[5]Smith BJ,Sivasithamparam K.Internal transcribed spacer ribosomal DNA sequence of five species of Ganoderma from Australial[J].Mycol Res,2000,104(8):943 - 951.
[6]胡曉冰,王振偉.TTC法在篩選西瓜果酒酵母中的應(yīng)用[J].釀酒科技,2011(2):69 -73.
[7]權(quán)英,張偉,李長文,等.釀造紅棗果酒的酵母菌選種研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(11):39-41.
[8]GB/T15038-2005,葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法[S].
[9]李華,涂正順,王華,等.獼猴桃果酒香氣成分的氣相色譜/質(zhì)譜分析[J].分析化學(xué),2002(6):695 -698.
[10]牛廣財(cái),朱丹,王軍,等.沙棘果酒優(yōu)良酵母茵的篩選及分子生物學(xué)鑒定[J].中國食品學(xué)報(bào),2009,9(6):60-65.
[11]Felsenstein J.Confidence limits on phylogenies:An approach using the bootstrap[J].Evolution,1985,39:783 -791.
[12]Heroult J,Bueno M,Potin Grautier M,et al.Organotin speciation in French brandies and wines by solid-phase microextraction and gas chromatography Pulsed flame photometric detection[J].Journal of Chromatography A,2008,1180(1 -2):122 -130.