王增仙，甄會(huì)賢，高蕭楓，武敏霞，李 平

(山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原 030031)

美法侖(又名L－溶肉瘤素)即左旋苯丙氨酸氮芥，是一種烷化劑。其基本作用同環(huán)磷酰胺，為雙功能烷化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，有細(xì)胞毒作用，并抑制蛋白質(zhì)的合成，為苯丙氨酸氮芥的左旋體，抗瘤作用稍強(qiáng)于消旋體(即溶肉瘤素)。臨床上美法侖可用于乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等，動(dòng)脈灌注可治療肢體惡性腫瘤，如惡性黑色素、骨肉瘤及軟組織肉瘤等。目前國(guó)內(nèi)尚無美法侖的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。為控制其質(zhì)量，本文根據(jù)新藥審批的有關(guān)規(guī)定要求，結(jié)合國(guó)外已有的標(biāo)準(zhǔn)，采用常用測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法考察美法侖中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法［1～3］。

1 儀器與材料

日本島津LC-10A高效液相色譜儀，島津紫外分光光度儀UV-160，醫(yī)用超聲波清洗器 KQ320，恒溫水浴鍋，電子天平。

美法侖原料(自制)，對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):20081204)，乙腈為色譜純，甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水、碳酸銨、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色 譜 柱:DiamonsilODS(4.6 mm× 150 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.375%碳酸銨的水溶液∶乙腈∶冰醋酸 (100∶35∶1.0);檢 測(cè) 波 長(zhǎng):260 nm;流 速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按美法侖峰計(jì)不低于5 000，拖尾因子在0.95～1.05之間，與相鄰峰的分離度大于1.5。色譜圖見圖1、圖2、圖3。

圖1 空白溶液色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of the Blank Solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig 2 HPLC Chromatograms of the Sample

圖3 對(duì)照品溶液色譜圖Fig 3 HPLC Chromatograms of the Reference Diosgenin

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定美法侖對(duì)照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1 mL置于100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度并搖勻，即得濃度為0.002 mg/mL的溶液。

2.2.3 空白溶液的制備 0.1 mol/L鹽酸溶液。

2.3 方法

2.3.1 檢測(cè)限和定量限的確定 調(diào)節(jié)色譜儀靈敏度，用0.1 mol/L的鹽酸溶液配制一定濃度的美法侖溶液，并逐步稀釋，邊稀釋邊進(jìn)樣，每次10 μL，直到美法侖峰的峰高為基線噪音的10倍左右，記錄色譜圖，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算，得定量限為0.000 002 6 mg/mL，繼續(xù)稀釋，當(dāng)美法侖峰的峰高為基線噪音的3倍左右時(shí)，記錄色譜圖，得檢測(cè)限為0.000 000 8 mg/mL。

2.3.2 線性測(cè)定及范圍 選擇從定量限到1%自身對(duì)照濃度的120%作為本品的線性考察范圍，本品的定量限為 0.000 002 6 mg/mL，1%自身對(duì)照濃度的120%為 0.002 4 mg/mL， 故 在 0.000 002 6 mg/mL～0.002 4 mg/mL范圍內(nèi)做線性實(shí)驗(yàn)。

精密稱定美法侖對(duì)照品適量，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作為貯備液。精密量取貯備液適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液分別稀釋成濃度為0.000 002 6 mg/mL、0.000 2 mg/mL、0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.002 4 mg/mL的溶液，進(jìn)樣分析。得線性方程:Y=7 000X+1 635，r=0.999 7。結(jié)果表明本品在0.000 002 6～0.002 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL。以峰面積值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%(n=5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液適量，分別于配制后第0、1、2、3、5 h末進(jìn)樣分析，其峰面積的 RSD 為1.28%，表明供試品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收率測(cè)定法，取本品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，共9 份，分別按50%、100%、150%精密加入對(duì)照品溶液適量各3份，按上述條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率和RSD值。3個(gè)濃度的平均回收率分別為 100.8%、99.1%、98.6%;RSD 分 別 為 0.93%、0.52%、0.89%。

2.5 破壞性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 氧化破壞實(shí)驗(yàn) 取本品約10 mg，加30%雙氧水15 mL，于90℃加熱2 min，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明降解產(chǎn)物峰明顯增大，且有關(guān)物質(zhì)峰和主峰達(dá)基線分離。色譜圖見圖4。

圖4 氧化破壞色譜圖Fig 4 HPLC Chromatograms of the Oxidative Damage

2.5.2 酸破壞實(shí)驗(yàn) 取本品約10 mg，加入0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL，于90℃加熱40 s，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，濾過，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明降解產(chǎn)物峰明顯增加，且有關(guān)物質(zhì)峰和主峰達(dá)基線分離。色譜圖見圖5。

2.5.3 堿破壞實(shí)驗(yàn) 取本品約10 mg，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，于80℃加熱40 s，用0.1 mol/L鹽酸溶液中和至中性，濾過，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明降解產(chǎn)物峰明顯增加，且有關(guān)物質(zhì)峰和主峰達(dá)基線分離。色譜圖見圖6。

圖5 酸破壞色譜圖Fig 5 HPLC Chromatograms of the Acid Damage

圖6 堿破壞色譜圖Fig 6 HPLC Chromatograms of the Base Damage

2.6 三批樣品有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)

照上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液10 μL注入液相色譜儀;記錄色譜圖至供試品溶液中美法侖峰保留時(shí)間的3倍;則供試品溶液中如有雜質(zhì)峰(溶劑峰除外)，計(jì)算各雜質(zhì)峰峰面積之和，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 3批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination Results of Related Substances in Three Batches of Samples

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取本品原料分別用流動(dòng)相溶液、0.1 mol/L的鹽酸溶液，配制成適宜濃度的溶液，分別在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，美法侖的流動(dòng)相溶液在260 nm處有最大吸收;其0.1 mol/L的鹽酸溶液也在260 nm處有最大吸收，所以最終選擇260 nm為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 溶劑的選擇

在有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定中，首選采用流動(dòng)相溶解樣品，經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本品在流動(dòng)相溶液中穩(wěn)定性不好，其有關(guān)物質(zhì)自溶解后有逐漸增加的趨勢(shì)，所以采用本品片劑溶出度測(cè)定的溶劑(0.1 mol/L鹽酸)來溶解樣品，檢驗(yàn)有關(guān)物質(zhì)，增加了溶液穩(wěn)定性，且空白溶劑不影響測(cè)定。

［1］劉利軍.反相高效液相色譜法測(cè)定普盧利沙星中的有關(guān)物質(zhì)［J］.中南藥學(xué)，2010，8(6):423-425.

［2］白玉紅，韓 慧，于海威，等.鹽酸氮卓斯汀片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16(12):115-116.

［3］張小松，江 生，毛 慶.磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)研究［J］.中國(guó)藥事，2009，23(7):690-691.