左 玲 貝鵬劍 胡國華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院婦科，上海市閘北區(qū)芷江中路274號，200071)

解脲脲原體是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，它不僅引起NGU，還可導(dǎo)致盆腔炎、不孕癥、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期感染、新生兒感染等疾病。近年來，在臨床上中藥治療支原體的優(yōu)勢越來越受到重視。胡國華教授進行中草藥體外抗Uu的藥敏研究，發(fā)現(xiàn)清熱解毒類的中藥具有較好的抗支原體作用［1－2］，盆炎湯是名老中醫(yī)朱南孫教授治療慢性盆腔炎的經(jīng)驗方，臨床上療效確切?，F(xiàn)將2009年9月至2010年3月于上海市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室所做的動物試驗——盆炎湯治療Uu感染小鼠生殖系統(tǒng)的療效報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性昆明種小鼠，體重(30±2)g，清潔級，8～10周，共63只，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。63只小鼠隨機分為7組，每組9只。1)正常組:注射雌激素，不接種Uu菌液;2)模型組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;3)西藥組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;4)中西藥結(jié)合組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;5)盆炎湯大劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;6)盆炎湯中劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液;7)盆炎湯小劑量組:注射雌激素，陰道接種Uu菌液。

1.2 試劑及藥品 Uu液體無菌培養(yǎng)液、Uu固體無菌培養(yǎng)基(以上均由上海恩康生物科技有限公司提供)，血清8型Uu菌株(購于美國菌種收藏中心，復(fù)蘇傳代)，阿奇霉素片(規(guī)格:0.25g/片，湖北廣濟藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:20090201)(參照2006年美國疾病預(yù)防控制中心性病治療指南專輯)，苯甲酸雌二醇(規(guī)格:2mg/mL，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:070402)，中藥盆炎湯組成:蒲公英30g，紅藤30g，延胡索15g，劉寄奴12g，續(xù)斷12g。煎煮濃縮后計算得所濃縮的最大濃度約為4.5g/mL。(上海市中醫(yī)醫(yī)院提供)。

1.3 方法

1.3.1 造模 參照文獻造模［3－4］:1)所有小鼠頸部皮下均注射苯甲酸雌二醇0.4mg/只，每周1次，共4次;2)所有小鼠注射雌激素1周后，除正常組外，其余小鼠均感染Uu。用微量移液器吸取處于對數(shù)生長期的Uu菌液50μL，伸入小鼠陰道約0.5cm，將Uu菌液緩緩注入小鼠陰道內(nèi)，注入完畢后將小鼠倒置半分鐘，使Uu菌液能充分與生殖道內(nèi)壁接觸。1周后取小鼠陰道分泌物進行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到Uu菌落表明造模成功。

1.3.2 藥物治療 造模成功后開始用藥。1)正常組:無菌純凈水灌胃0.5mL/次×14d;2)模型組:無菌純凈水灌胃0.5mL/次×14d;3)西藥組:阿齊霉素0.21g/kg，灌胃、頓服;4)中西藥結(jié)合組:阿齊霉素0.21g/kg，頓服;盆炎湯小劑量灌胃×13d;5)盆炎湯大、中、小劑量組:分別用4.5g/mL、2.25g/mL、1.13g/mL的中藥湯劑灌胃0.5mL/次×14d。

1.3.3 觀察 實驗過程中觀察小鼠的飲食、飲水情況，體重變化，毛色變化，生殖道分泌物及大小便情況。

1.3.4 白介素檢測 處死小鼠前采用股動脈取血法，將所取血液及時離心后取上清液，采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測小鼠血清中白介素－1β、白介素－6的濃度。

1.3.5 凋亡 實驗結(jié)束處死各組小鼠，剖腹，肉眼觀察小鼠陰道分泌物、子宮等腹腔內(nèi)情況。取部分陰道、子宮組織，用10%甲醛固定，做病理HE染色，切片。用TUNEL法檢測小鼠陰道、子宮組織凋亡細胞數(shù)量。

1.3.6 統(tǒng)計分析 利用SPSS18.0軟件完成，采用方差分析方法(剔除偏差太大的數(shù)值，檢測方差齊)。

2 結(jié)果

2.1 觀察結(jié)果 接種Uu菌液后第2～3周小鼠的飲水量明顯增加，陰道周圍紅腫，分泌物增多，個別小鼠生殖道周圍有脫毛伴液體滲出現(xiàn)象。小鼠的尿液氣味臭穢，尿量增多，色黃。處死小鼠時發(fā)現(xiàn)部分小鼠有子宮增粗、水腫，子宮壁變薄，剪開子宮組織可見有腔內(nèi)有透明液體流出，部分小鼠有子宮變硬的現(xiàn)象。也可見小鼠膀胱內(nèi)膿性分泌物，膀胱壁變厚，甚則壞死。

2.2 白介素－1β及白介素－6比較結(jié)果 經(jīng)F檢驗，白介素－1β模型組、西藥組及中藥小劑量組與正常組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，從均值可以看出，中西藥結(jié)合組、中藥大、中劑量組的白介素－1β較其他組有降低的趨勢;白介素－6各干預(yù)組存在較模型組降低的趨勢，其中中藥大劑量組的降低最為明顯，見表1。

表1 白介素－1β及白介素－6比較(±s)

表1 白介素－1β及白介素－6比較(±s)

注:模型組、西藥組、中藥小劑量組與正常組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) IL－1β(pg/mL) IL－6(pg/mL)8 29.37±16.41 29.38±19.51模型組 8 45.47±11.72* 30.22±11.05西藥組 9 47.60±20.27* 26.29±9.21中西藥組 9 36.65±10.33 24.15±7.08中藥大劑量 9 39.43±13.73 27.89±8.69中藥中劑量 8 34.0±9.93 26.78±8.20中藥小劑量 9 47.10±16.68*正常組27.67±6.97

2.3 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較結(jié)果從均值可以看出子宮組織細胞凋亡率干預(yù)各組存在較模型組降低的趨勢，尤以西藥組、中西藥組、中藥大劑量組為明顯。與模型組相比較各組陰道組織細胞凋亡率均有明顯降低的趨勢，且以中藥大劑量組最為明顯。見表2。

表2 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較(±s)

表2 各組小鼠子宮組織及陰道組織凋亡比較(±s)

注:正常組、中西藥組、中藥大劑量組與模型組比較，＊＊P＜0.01;西藥組、中藥中小劑量組與模型組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 子宮組織 陰道組織正常組 8 7.11±2.80 5.74±2.80＊＊模型組 8 7.38±3.03 9.88±3.00西藥組 9 6.41±1.97 7.53±1.91*中西藥組 9 5.31±0.94 6.89±2.57＊＊中藥大劑量 9 5.46±1.86 5.93±1.59＊＊中藥中劑量 8 6.91±2.41 7.01±1.20*中藥小劑量 9 5.96±1.22 7.26±2.39*

3 討論

細胞凋亡是1972年首先由英國科學(xué)家Kerr提出的，細胞凋亡是細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，但是細胞凋亡過多將導(dǎo)致組織損傷和功能紊亂。支原體細胞膜中含有豐富的脂蛋白，稱為脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白，有學(xué)者認為支原體的致病性可能與該膜蛋白有關(guān)。支原體LAMPs主要通過直接致病作用和免疫損傷等機制參與宿主細胞的損傷和凋亡［5］，LAMPs能影響淋巴細胞和單核細胞膜的通透性，從而誘導(dǎo)這些細胞釋放ATP，后者能與免疫細胞膜上的P2嘌呤受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死［6］。LAMPs具有很強的抗原性，并能以較高的頻率發(fā)生相變異。它可以刺激人單核細胞、巨噬細胞等分泌腫瘤壞死因子－a、白介素－1β、白介素－6，而腫瘤壞死因子－a、白介素－1β等都是前炎癥的細胞因子，是啟動急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性細胞因子，是啟動細胞凋亡的重要細胞因子，與細胞凋亡關(guān)系密切［7－10］。本實驗中觀察到Uu感染小鼠不同程度的出現(xiàn)膀胱病變、子宮組織水腫等，及白介素－1β濃度模型組、西藥組及中藥小劑量組與正常組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明Uu感染后可以上行感染，刺激炎癥反應(yīng)。張迅［11］等研究表明Uu可致生殖細胞凋亡增加，陰道組織細胞凋亡各組與模型組相比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中正常組、中西藥組、中藥大劑量組與模型組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，西藥組、中藥中、小劑量組與模型組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);說明Uu感染后陰道組織細胞凋亡增加，用藥后可以減少炎癥反應(yīng)，從而抑制細胞凋亡的產(chǎn)生，其中以中西藥結(jié)合及中藥大劑量對陰道組織細胞的凋亡抑制作用最為顯著;西藥、中藥中、小劑量對陰道組織細胞的凋亡也有抑制作用。均值提示子宮組織細胞凋亡干預(yù)各組存在較模型組降低的趨勢，尤以西藥組、中西藥組、中藥大劑量組為明顯;陰道組織細胞凋亡各組與模型組相比較均有明顯降低的趨勢，中藥大劑量組降低最為明顯。

綜上，盆炎湯可以抑制白介素－1β及白介素－6的產(chǎn)生，從而減輕支原感染炎癥反應(yīng)所造成的病理損傷，降低支原體感染所造成的生殖細胞凋亡，并且這種作用隨著用藥劑量的增加而增強。

［1］Taylor－ robinson D.，F(xiàn)urr P.M..Observations on experimental colonisation of mice by ureaplasmas of human origin［J］.Med Microbiol，2002，51:866－870.

［2］潘展硯，黃欣，黃崢燁，等.解脲脲原體陰道炎動物模型建立及強力霉素治療療效觀察［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2007，21(12):741－743.

［3］胡國華，葉元康，夏英，等.抗溶脲脲原體的中草藥篩選的實驗研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1998，17(3):43 －45.

［4］左玲，胡國華.中藥對乳酸桿菌與解脲脲原體臨床分離株的體外抑制實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(12):2999 －3000.

［5］何軍，吳移謀.支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白的研究進展［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2008，24(11):1074 －1076.

［6］Into T，Okada K，Inoue N，et al.Extracellular ATP regulates cell death of lymphocytes and monocytes induced by membrane－bound lipoproteins of Mycoplasma fermentans and Mycoplasma salivarium［J］.Microbiol Immunol，2002，46(10):667 － 675.

［7］Mühlradt，P.F.，F(xiàn)risch，M.Purification and partial biochemical characterization of a Mycoplasma fermentans－derived substance that activates macrophages to release nitric oxide，tumor necrosis factor，and interleukin－6［J］.Infect Immun，1994，62(9):3801 －3807.

［8］曾焱華，吳移謀，鄧仲良，等.穿透支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白誘導(dǎo)人單核細胞產(chǎn)生炎癥性細胞因子［J］.中華傳染病雜志，2006，24(4):251－253.

［9］Bijangi－ Vishehsaraei K，Saadatzadeh M.R，Werne A，et al.Enhanced TNF－α–induced apoptosis in Fanconi anemia type C–deficient cells is dependent on apoptosis signal－ regulating kinase 1［J］.Blood，2005，106(13):4124－4130.

［10］魯杰，趙小元，孫寶嶺，等.肺炎支原體對小鼠腹腔巨噬細胞激活作用的研究［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2006，22(5):477 －478.

［11］張迅，何清湖，劉朝圣.知柏地黃湯對解脲脲原體感染大鼠動物模型生殖細胞凋亡及Fas、FasL表達的影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，25(1):9 －11.