孫 秋， 趙浩宇， 侯太平

(1. 四川大學(xué) a. 華西藥學(xué)院 靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b. 生命科學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064)

在全球范圍類，農(nóng)作物由于植物病害產(chǎn)量劇烈減少，其中由植物病原菌引起的損失占了相當(dāng)大的一部分[1～4]。水稻紋枯病、小麥赤霉病、蘋果腐爛病和葡萄黑豆病是影響農(nóng)作物的常見病害，發(fā)生范圍廣，危害損失大。通過化學(xué)農(nóng)藥對植物病菌進(jìn)行防治，是目前生產(chǎn)上最主要的手段[5]。但是，隨著這類化合物的使用時(shí)間的延長，病害菌的抗性也越來越強(qiáng)，導(dǎo)致了該類殺菌劑活性降低，甚至在一些地區(qū)喪失了殺菌能力[6]。因此，研發(fā)新型的殺菌劑具有非常重要的意義。

在抗真菌農(nóng)藥創(chuàng)制過程中發(fā)現(xiàn)，N-{1-[3-(4-溴-2-甲基)丙烯酰]咪唑烷-2-亞基}硝酰胺(Ⅰ)和N-{3-[2-氧代-2-(吡咯烷-1-基)乙基]噻唑烷-2-亞基}氰胺(Ⅱ)具有良好的抗真菌活性，且目前對該類化合物的抗真菌活性尚未見報(bào)道。

本文以芳甲酰氯(4a～4g)，芳乙酰氯(5a～5c)2-硝基亞胺咪唑烷和2-氰基亞胺1，3-噻唑烷為主要原料，設(shè)計(jì)并合成了5個(gè)新型的2-硝基亞氨基咪唑烷(1a～1e)和10個(gè)新型的2-氰基亞氨基-1,3-噻唑烷衍生物(2a～2g和3a～3c， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。并對其進(jìn)行了初步的生物活性測試。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Bruker AV 400 Hz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))。

薄層色譜用硅膠GF254和柱層析用硅膠(300目～400目)，青島海洋化工廠；水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、蘋果腐爛病菌和葡萄黑豆病菌，四川省農(nóng)科院；所用試劑均為分析純，其中CH2Cl2經(jīng)干燥重蒸處理。

1．2 合成[7]

(1) 4的合成(以4c)為例

在干燥的反應(yīng)瓶中加入4-甲基肉桂酸432.4 mg(2 mmol), N2保護(hù)下滴加DMF 1滴～2滴;加入CH2Cl25 mL，于0 ℃攪拌使其完全溶解；緩慢滴加草酰氯0.17 mL(2 mmol)，滴畢，于室溫反應(yīng)2 h～3 h。減壓濃縮后用CH2Cl2(5 mL)稀釋得含4c的CH2Cl2溶液A。

用類似的方法合成4a,4b,4d～4g的CH2Cl2溶液。

(2) 5的合成(以5b為例)

在干燥的反應(yīng)瓶中加入嗎啉0.20 mL(2.3 mmol)， N2保護(hù)下加入CH2Cl25 mL，攪拌下于0 ℃緩慢滴加氯乙酰氯0.16 mL(2 mmol)，滴畢，反應(yīng)2 h～3 h。減壓濃縮后用CH2Cl2(5 mL)稀釋得含5b的CH2Cl2溶液B。

用類似的方法合成5a和5c的CH2Cl2溶液。

(3) 1和2的合成(以1c為例)

在干燥的反應(yīng)瓶中加入2-硝基亞氨基咪唑烷， N2保護(hù)下加入CH2Cl210 mL，攪拌使其完全溶解；滴加Et3N 0.05 mL(0.35 mmol)，滴畢，反應(yīng)5 min;冰水浴冷卻，緩慢滴加溶液A，滴畢，于室溫反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶1]分離得(E)-N-{3-[(E)-3-p-甲苯丙烯酰]2-亞咪唑烷基)硝酰胺(1c)。

用類似的方法合成1a,1b,1d～1e。

用2-氰基亞氨基-1,3-噻唑烷替代2-硝基亞氨基咪唑烷，用類似的方法合成2a～2g。

(4) 3的合成(以3b為例)

在干燥的反應(yīng)瓶中加入2-氰基亞氨基-1,3-噻唑烷260．2 mg(2 mmol)， N2保護(hù)下加入CH2Cl210 mL，攪拌使其完全溶解；滴加Et3N0.05 mL(0.35 mmol)，滴畢，攪拌5 min。冰水浴冷卻下，緩慢滴加溶液B，滴畢，于室溫反應(yīng)30 min；回流反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=1 ∶1)分離得(Z)-N-{3-[2-(嗎啉-4)-2-氧乙基]2-亞噻唑烷基}氨基腈(3b)。用類似的方法合成3a和3c。

合成1～3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1, NMR數(shù)據(jù)見表2。

表1 合成1～3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of synthesizing 1～3

表2 1～3的NMR數(shù)據(jù)Table 2 NMR data of 1～3

續(xù)表2

Comp1H NMR δ(J/Hz)13C NMR δ2c2.40(s, 3H), 3.41～3.45(m, 2H), 4.47～4.50(m, 2H), 7.23(d, J=8.0, 2H), 7.49(d, J=8.0, 2H), 7.63(d, J=15.2, 1H), 7.83(d, J=15.6, 1H)21.6, 27.0, 49.0, 114.4, 117.1, 128.7, 129.8, 131.5, 141.7,147.5, 165.0, 176.72d2.11(s, 3H), 3.49(t, J=7.2, 2H), 4.33～4.36(m, 2H), 6.92(s, 1H), 7.24-～7.26(m, 2H), 7.54(d, J=8.4, 2H)15.5, 27.6, 52.2, 114.2, 118.8, 122.8, 131.0, 131.7, 132.4, 133.9, 135.9, 171.0, 176.52e2.24(s, 3H), 3.48～3.51(m, 2H), 4.44～4.47(m, 2H), 7.09(d, J=8.4, 2H), 7.24(d, J=8.4, 1H), 7.29(d, J=2.0, 1H), 7.32(d, J=8.4, 2H), 7.43(d, J=2.0, 1H)8.9, 28.0, 52.4, 114.2, 118.3, 126.5, 128.0, 129.0, 130.3, 130.5, 130.7, 133.0, 135.1, 135.7, 136.2, 142.7, 145.1, 162.9, 176.92f3.48～3.52(m, 2H), 4.36～4.40(m, 2H), 7.12～7.14(m, 1H), 7.71～7.74(m, 2H)27.8, 53.3, 114.2, 127.8, 134.8, 135.3, 135.5, 161.9, 177.12g3.49(t, J=3.2, 2H), 4.31(s, 2H), 4.33(t, J=3.2, 2H), 6.97(t, J=7.6, 1H), 7.07(t, J=8.0, 1H), 7.35(d, J=8.0, 1H), 7.46(d, J=8.0, 1H), 7.20(d, J=2.0, 1H), 7.35(d, J=8.0, 1H), 7.46(d, J=8.0, 1H), 10.95(s, 1H)27.2, 34.3, 52.5, 106.7, 111.6, 115.0, 118.6, 119.0, 121.2, 124.6, 127.5, 136.3, 170.7, 178.33a1.57～1.67(m, 6H), 3.35(t, J=5.2, 2H), 3.42～3.46(m, 2H),3.52～3.54(m, 2H), 4.02～4.05(m, 2H), 4.25(s, 2H)24.3, 25.4, 26.3, 27.7, 43.2, 46.0, 47.2, 53.8, 117.2, 163.6, 175.33b3.44～3.49(m, 4H), 3.60～3.63(m, 2H), 3.70～3.74(m, 4H), 4.03～4.07(m, 2H), 4.26(s, 2H)27.6, 42.1, 45.2, 46.9, 53.7, 66.2, 66.5, 117.0, 164.1, 175.43c1.85～1.92(m, 2H), 1.98～2.05(m, 2H), 3.43～3.50(m, 6H), 4.09(t, J=7.6, 2H), 4.17(s, 2H)24.1, 26.1, 27.7, 45.9, 46.1, 47.9, 53.8, 164.0, 175.3

2 結(jié)果與討論

參照文獻(xiàn)[8，9]方法作抑菌活性測試，在150 mL三角瓶加入PDA培養(yǎng)基60 mL，滅菌備用。用0.05% Tween 20滅菌水配成濃度為20 mg·L-1的待測藥樣，加入培養(yǎng)基中，于45 ℃～50 ℃充分搖勻后倒入直徑為9 cm的滅過菌的培養(yǎng)皿中，每組三個(gè)重復(fù)，以等量的溶劑為空白對照。以打孔器(內(nèi)徑4 mm)將生長正常的菌落打孔制成若干菌餅備用，用接種針將菌餅移接到平板中央，每個(gè)培養(yǎng)皿接一個(gè)菌餅，置于27 ℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組長滿時(shí)，測量菌落的直徑。每個(gè)菌落用十字交叉法測量2次，以平均數(shù)代表菌落的大小，計(jì)算相對抑制率[抑制率=(直徑空白-直徑藥樣/直徑空白)×100%]。

將待測藥樣用丙酮溶解，采用二倍稀釋法制備各種濃度培養(yǎng)基，在無菌操作下接種上述新鮮菌種，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)組，于27 ℃倒置培養(yǎng)，待菌落直徑長到平板的2/3時(shí)，采用十字交叉法測量直徑，再將六個(gè)數(shù)據(jù)平均，計(jì)算EC50值。

1～3對水稻紋枯病菌(A)，小麥赤霉病菌(B)、蘋果腐爛病菌(C)和葡萄黑豆病菌(D)的抑菌活性見表3。從表3可見，在濃度為20 mg·L-1時(shí)，除3a和3b外，其余15個(gè)2-硝基亞氨基咪唑烷類和N-氰基噻唑烷類衍生物均具有一定的抑菌活性。在濃度為0.02 mg·mL-1下,1d和2d對A的抑制率分別為44.15%, 58.97%；1e和2e對B的抑制率分別為48.91%， 54.46%，對C的抑制率分別為70.69%， 80.63%，對D的抑制率分別為58.87%， 62.02%。由于1e和2e表現(xiàn)出良好的抑菌活性，故進(jìn)一步測定了他們對C和D的EC50值。結(jié)果表明，1e和2e對C的EC50分別為4．5 mg·L-1, 8.6 mg·L-1,對D的EC50分別為11.7 mg·L-1, 14.3 mg·L-1。1e和2e對D的EC59均優(yōu)于陽性對照藥多靈多(對C和D的EC50分別為1.6 mg·L-1， 33．4 mg·L-1)。

表3 1～3的抑菌活性*Table 3 Antifungal activities of 1～3

*c0.02 mg·mL-1； A：水稻紋枯病菌； B：小麥赤霉病菌； C：蘋果腐爛病菌； D：葡萄黑豆病菌

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)并合成了5個(gè)新型的2-硝基亞氨基咪唑烷衍生物(1a～1e)和10個(gè)新型的2-氰基亞氨基-1,3-噻唑烷衍生物(2a～2g和3a～3c)。生物活性測試結(jié)果表明，在濃度為20 mg·L-1時(shí)，除3a和3b外，其余化合物對水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌，蘋果腐爛病菌和葡萄黑豆病菌均有一定的抑菌活性。其中1e和2e具有抗菌農(nóng)藥的開發(fā)潛力，與其他2-硝基亞氨基咪唑烷類和N-氰基噻唑烷類衍生物比較，鹵素原子可能是影響該類化合物抗真菌活性的重要因素。1d和2d都含有一個(gè)溴原子，1e和2e含有三個(gè)氯原子。另外，1e和2e中均含有額外的一個(gè)吡唑環(huán)，這也可能是其活性高于其他衍生物的重要因素。以上構(gòu)效關(guān)系的初步討論將有助于此類抑菌活性更高的化合物的設(shè)計(jì)與合成。目前，基于1e和2e的化合物的結(jié)構(gòu)修飾與合成的研究正在進(jìn)行當(dāng)中。

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