姜 波， 魏 冬， 范九良， 汪佳鳳， 周雙生

(安徽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031)

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃素不僅能行氣、驅(qū)蟲、散風(fēng)活血、通經(jīng)止痛等,常用于治療皮膚病、鼻炎、肝膽疾患、風(fēng)濕病，而且還具有抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡等廣泛的藥理活性，毒性又小，是一種很有發(fā)展前景的抗腫瘤藥物[1,2]。但由于其穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物利用度低、用藥量大而限制了其推廣使用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于金屬離子與DNA的某些親核基團(如磷酸氧位點或堿基氮、氧位點)直接螯合，引起癌細(xì)胞的DNA損傷，使DNA在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時受到障礙，從而阻止了癌細(xì)胞的生長和分裂，并導(dǎo)致其死亡[3]。小分子與DNA之間的相互作用有三種方式(嵌插作用，溝槽作用和靜電引力作用)，通過了解小分子與DNA鍵合作用機制，就能為以DNA為靶點的新型高效抗癌藥物的設(shè)計提供指導(dǎo)性和可行性信息[4]。

為了進一步研究和探討姜黃素類物質(zhì)的生物活性，本文以姜黃素為起始原料，設(shè)計并合成了配體二乙酰姜黃素(H2L)及其金屬[銅(Ⅱ)和鉑(Ⅱ)]配合物(CuL2和PtL2， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR， MS和元素分析確認(rèn)。采用紫外可見光譜法和循環(huán)伏安法研究了CuL2和PtL2與小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。結(jié)果表明，CuL2和PtL2與ctDNA的作用屬嵌插作用模式。

ML2(M=Cu， Pt)

Scheme1

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

UV-2450型紫外光譜儀；752PC型紫外分光光度計；Bruker 400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet Avatar 370DTGS型紅外光譜儀(KBr壓片)；Perkin-Elmer 2400CHN型元素分析儀；PHS-3CA型精密酸度計；CHI660B型電化學(xué)分析儀；LK2005A型電化學(xué)工作站。

姜黃素，國藥集團；ctDNA, Sigma；其余所用試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1．2 合成

(1) H2L的合成[6]

在圓底燒瓶中加入姜黃素1 g(2.7 mmol)，二氯甲烷75 mL，加熱攪拌使其溶解；加入吡啶5 mL和乙酸酐8 mL(84.8 mmol)，回流反應(yīng)3.5 h[溶液由橘紅色變?yōu)榈S色;TLC檢測，展開劑：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]。蒸除大部分溶劑后加甲醇100 mL，冷卻析晶得黃色固體，用混合溶劑[V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=3 ∶2]重結(jié)晶得淡黃色晶體H2L，產(chǎn)率71.7%， m.p．157 ℃～158 ℃；1H NMRδ： 7.62～7.12(m, 6H, ArH)， 7.07～6.68(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.88(s， 6H, ArOCH3)， 2.39(s， 6H, COCH3), 2.26(s, 2H, CH2)； IRν： 1 712， 1 598, 1 508， 1 435, 1 254， 1 028； ESI-MSm/z： 452(M+)； Anal.calcd for C25H24O8： C 66.36， 5.35； found C 66.67， H 5.73。

(2) CuL2和PtL2的合成[7，8]

在圓底燒瓶中依次加入H2L 0.14 g(0.3 mmol)，無水乙醇35 mL及1 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.3 mL,攪拌下于室溫滴加醋酸銅30.0 mg(0.15 mmol)的乙醇(3 mL)溶液，滴畢，回流(80 ℃)反應(yīng)6 h。過濾，濾餅依次用二氯甲烷(3×15 mL)和水(3×15 mL)洗滌，于60 ℃真空干燥12 h得黃色粉末CuL2。

用四碘合鉑酸鉀代替醋酸銅，用類似方法合成棕色粉末PtL2。

CuL2： 收率74.5%， m.p．>280 ℃；1H NMRδ： 7.72～7.18(m, 6H, ArH)， 7.13～6.72(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.95(s， 6H, ArOCH3)， 2.45(s， 6H, COCH3), 2.30(s, 2H, CH2)； IRν： 1 593， 1 525， 1 507， 1 447, 1 297， 1 255， 1 195， 546 cm-1； Anal.calcd for C50H46O16Cu(Mr=965.5)： C 62.14， H， 4.80， Cu， 6.57； found C 61.88， H 5.02， Cu 6.62。

PtL2： 收率57.1%， m.p>280 ℃；1H NMRδ： 7.74～7.19(m, 6H, ArH)， 7.15～6.71(d，J=7.8 Hz, 4H， =CH)， 3.93(s， 6H, ArOCH3)， 2.46(s， 6H, COCH3), 2.31(s, 2H, CH2)； IRν： 1 592， 1 526， 1 508， 1 446, 1 295， 1 259， 1 196， 544 cm-1; Anal.calcd for C50H46O16Pt(Mr=1097.1)： C 54.70， H 4.22， Pt 17.76； found C 54.56， H 4.32， Pt 17.83。

1．3 CuL2和PtL2與ctDNA的相互作用測定

將配合物用混合溶劑A{5 mmol·L-1Tris-HCl[三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸]100 mL+50 mmol·L-1NaCl(pH 6.86)緩沖溶液900 mL}配成濃度(c)為1．0×10-4mol·L-1溶液。 ctDNA用A配成不同濃度的溶液，于4 ℃保存待用。 ctDNA在260 nm和280 nm處的吸光度比值為1.85，表明ctDNA達到實驗要求[5]。

用混合溶劑A作空白對照液，測定時樣品池和空白池分別裝3 mL溶液,用微量注射器分別加入50 μL的ctDNA溶液，充分混合后靜止5 min，在200 nm～350 nm內(nèi)掃描，觀察UV吸收曲線變化。

設(shè)置CHI660B電化學(xué)分析儀參數(shù)：掃描電壓-1000 mV～1000 mV，掃描速率100 mV·s-1，掃描次數(shù)3次，間隔時間10 s。取Tris-HCl(pH 6.86)的NaCl緩沖溶液于電解池中，注入50 μL待測配合物溶液，浸入電極,通N2，攪拌5 min；在設(shè)置的條件下測定其未加ctDNA的循環(huán)伏安曲線;每次以遞增方式加入50 μL的ctDNA溶液，共測3次，觀察循環(huán)伏安曲線的變化。

2 結(jié)果與討論

2．1 表征

H2L的IR分析結(jié)果表明，位于3 412 cm-1處的姜黃素酚羥基伸縮振動峰消失，只在1 712 cm-1和1 598 cm-1處出現(xiàn)羰基吸收峰，表明酚羥基上的氫已被乙?；〈?；在1 712 cm-1附近出現(xiàn)比較弱的吸收峰，是羰基的伸縮振動，強度很弱；1 598 cm-1附近是烯醇式異構(gòu)體羰基伸縮振動，峰形強且尖銳。兩個配合物的IR譜圖相似，表明結(jié)構(gòu)相似。CuL2的羰基伸縮振動吸收峰在1 593 cm-1(PtL2在1 592 cm-1)處，相對于L的烯醇式異構(gòu)體的羰基峰稍稍藍移，說明L以烯醇式異構(gòu)體與M2+發(fā)生螯合配位，降低了羰基振動頻率[9]；其次，L在1 028 cm-1附近的νO-H┈O烯醇式伸縮振動峰消失，而在1 525 cm-1附近處出現(xiàn)較強的νC=C伸縮振動峰，這是烯醇負(fù)離子發(fā)生M-O配位的特征[10]。另外，在CuL2中出現(xiàn)了新的546 cm-1峰(PtL2在544 cm-1)，歸屬于β-二酮的羰基氧與金屬鍵合吸收峰[11]。配合物的1H NMR分析結(jié)果與H2L比較發(fā)現(xiàn),形成配合物后,L的各種質(zhì)子的化學(xué)位移均向低場發(fā)生了不同程度的位移,這也說明了L與M2+發(fā)生了配位作用[12]。

以DMF為溶劑，于25 ℃下在濃度為1.0×10-3mol·L-1溶液里測得CuL2和PtL2的摩爾電導(dǎo)值分別為27.8 s·cm2·mol-1和25.6 s·cm2·mol-1,表明它們均為非電解質(zhì)。

結(jié)合元素分析和1H NMR結(jié)果，配合物的可能結(jié)構(gòu)推斷如Scheme 1所示。

2．2 CuL2和PtL2與ctDNA的鍵合作用

(1) UV-Vis法測定

λ/nm圖1 CuL2與ctDNA在緩沖溶液(pH 6.86)中的UV-Vis譜圖*Figure 1 UV-Vis spectra of CuL2 with ctDNA at pH 6.86 buffer solution*c(CuL2)=1.0×10-4 mol·L-1， c(ctDNA)=(0.0, 0.5, 1.0, 1.5)×10-4 mol·L-1

λ/nm圖2 PtL2與ctDNA在緩沖溶液(pH 6.86)中的UV-Vis譜圖*Figure 2 UV-Vis spectra of PtL2 with ctDNA at pH 6.86 buffer solution*同圖1

E/V圖3 CuL2與ctDNA在緩沖溶液(pH 6.86)中的循環(huán)伏安曲線*Figure 3 Cyclic voltammogram curve of CuL2 with ctDNA at pH 6.86 of buffer solution*同圖1

E/V圖4 PtL2與ctDNA在緩沖溶液(pH 6.86)中的循環(huán)伏安曲線*Figure 4 Cyclic voltammogram curve of PtL2 with ctDNA at pH 6.86 of buffer solution*同圖1

圖1和圖2為CuL2和PtL2與ctDNA的鍵合作用UV-Vis光譜圖。從圖1和圖2可見，隨著c(ctDNA)增大，各配合物在275 nm和350 nm附近處的峰明顯不斷減小，且最大吸收波長表現(xiàn)出紅移現(xiàn)象，按照Long E.C[13]理論，推測配合物與ctDNA鍵合作用屬于嵌插模式。

(2) 循環(huán)伏安法測定

圖3和圖4為CuL2和PtL2與ctDNA的鍵合作用的循環(huán)伏安曲線。從圖3和圖4可見，小分子的伏安峰電位升高、正移，表明配合物與ctDNA作用是嵌入作用[14]，這與UV-Vis法結(jié)論相一致。另外，氧化還原峰電流(Ipa)隨著c(ctDNA)的增加而逐漸降低，這是因為配合物結(jié)合了分子量大且擴散速率慢的ctDNA分子的緣故[15]。

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