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        難治性癲癇患者致癇灶中CX43的表達(dá)

        2012-11-21 02:39:04張立志馮俊強(qiáng)陳晶宋宏杉陳業(yè)鵬
        中國實(shí)用醫(yī)藥 2012年10期
        關(guān)鍵詞:縫隙連接星形陽性細(xì)胞

        張立志 馮俊強(qiáng) 陳晶 宋宏杉 陳業(yè)鵬

        癲癇(epilepsy,EP)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一,目前仍以藥物治療為主,約有80%的患者經(jīng)過系統(tǒng)的抗癲癇治療癥狀可緩解或治愈,但仍有20%左右對現(xiàn)有藥物治療無效,成為難治性癲癇[1]。癲癇的發(fā)病機(jī)制涉及諸多方面,其中神經(jīng)元之間的聯(lián)絡(luò)在癲癇發(fā)作中也起重要作用。神經(jīng)元之間最簡單的信息傳遞形式是電突觸,而縫隙連接(gap junction,GJ)是神經(jīng)元電突觸的基本結(jié)構(gòu)[2],所以縫隙連接、縫隙連接蛋白(connexin,CX)與癲癇的關(guān)系倍受研究者的關(guān)注。目前針對GJ與癲癇的研究很多,但難治性癲癇患者致癇灶腦組織CX43的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。本研究利用免疫組織化學(xué)方法觀察24例難治性癲癇患者手術(shù)切除的致癇灶腦組織及因腦外傷手術(shù)切除的正常腦組織中CX43的表達(dá)情況,并進(jìn)行比較。進(jìn)一步闡明CX43形成的縫隙連接在癲癇活動(dòng)中的作用,為難治性癲癇的臨床研究及治療提供新的思路。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 24例難治性癲癇手術(shù)患者中,男12例,女12 例,男女比例1∶1。年齡17 ~58 歲,平均(28.3±11.1)歲,近3個(gè)月發(fā)作頻率5~40次/月,平均(15.3±11.8),患者病程2~29年,平均(8.3±7.8)。全部病例病史均在二年以上,經(jīng)過兩種或兩種以上抗癲癇藥物系統(tǒng)治療,癲癇發(fā)作每個(gè)月4次以上,經(jīng)影像學(xué)、頭皮長程腦電圖或顱內(nèi)皮層腦電圖監(jiān)測明確致癇灶,具有手術(shù)指征者。所有患者均在皮層電極監(jiān)測下行致癇灶切除手術(shù),切除病灶有額葉、顳葉、枕葉、海馬。術(shù)后病理證實(shí)為:腦組織皮質(zhì)分層紊亂,神經(jīng)元分布不均,膠質(zhì)細(xì)胞增生。對照組腦外傷急診手術(shù)6例患者,女2例,男4例,男女比例2∶1。年齡17~55歲,平均(36.5 ±16.8)歲,均無癲癇發(fā)作及癲癇病史。

        1.2 標(biāo)本制作及腦組織中CX43表達(dá)的檢測 采集實(shí)驗(yàn)組24例及對照組6例手術(shù)切除腦組織,切塊并分別置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液和2%~3%戊二醛中固定。①免疫組織化學(xué)法檢測(SP法):標(biāo)本行石蠟包埋、切片、脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4)沖洗3次,3 min/次。對組織抗原進(jìn)行熱修復(fù):pH6.0、0.01 mmol/L的檸檬酸抗原修復(fù)液中煮沸15 min。應(yīng)用SP超敏試劑盒按照說明進(jìn)行操作。應(yīng)用DAB試劑盒配制DAB液,每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液,顯微鏡下觀察3 min。自來水沖洗,蘇木精復(fù)染。自來水沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)過75%、80%、95%、95%、100%酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。實(shí)驗(yàn)組與對照組分別于400倍光學(xué)顯微鏡下,隨機(jī)選取5個(gè)視野,記錄鏡下陽性細(xì)胞數(shù),取其均數(shù)。

        2 結(jié)果

        免疫組化方法檢測致癇灶腦組織CX43的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組及對照組腦組織中均檢測到CX43的陽性細(xì)胞,主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,經(jīng)DAB染色,神經(jīng)細(xì)胞胞漿及胞膜顯棕色,因不同腦區(qū)腦皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不同,故免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的形態(tài)也不相同,癲癇患者腦皮質(zhì)CX43抗體陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多,而正常腦皮質(zhì)細(xì)胞胞漿及胞膜CX43抗體陽性細(xì)胞表達(dá)稀少(見表1,圖1~2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細(xì)胞的表達(dá)(±s)

        表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細(xì)胞的表達(dá)(±s)

        注:與對照組比較,*P <0.001

        組別 例數(shù)CX43對照組612.0 ±7.0實(shí)驗(yàn)組 24 50.5 ±9.7*

        圖1 對照組少量CX43陽性細(xì)胞表達(dá)(400倍)

        圖2 實(shí)驗(yàn)組CX43陽性細(xì)胞表達(dá)增多(400倍)

        3 討論

        縫隙連接是由鄰近兩個(gè)細(xì)胞細(xì)胞膜上相對應(yīng)的半通道(hemichannel)對接而成,是目前所知細(xì)胞間惟一能直接交換物質(zhì)和信息的通道[3]。而細(xì)胞間通過GJ為途徑直接進(jìn)行的細(xì)胞間的信息交流成為縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)。GJ的基本結(jié)構(gòu)單位是連接子(connexon)或稱半通道。連接子是由六個(gè)縫隙連接蛋白寡聚成的一種中空的親水性的環(huán)狀六聚體結(jié)構(gòu)[4]。GJ中的半通道直徑約1.5nm,允許分子量小于1.0 kD和直徑小于1.5nm的小分子物質(zhì)通過,如代謝分子、離子、第二信使(Ca2+,IP3,cAMP 和 ATP)及代謝產(chǎn)物如葡萄糖等通過[5]。CX是一類具有高度保守性的,由多基因編碼的膜蛋白[6]。CX的組織分布具有一定的特異性,而且不同CX組成的半通道可以相互配對排列組成不同種類的細(xì)胞間GJ。不同細(xì)胞細(xì)胞膜上GJ的種類及數(shù)目分布不同,其功能也不相同。數(shù)個(gè)至數(shù)千個(gè)GJ在細(xì)胞膜上成簇出現(xiàn)則形成縫隙連接斑(gap junction plaque),GJ的數(shù)量決定著斑塊的大小以及GJIC的強(qiáng)度[7,8]。有11 種 CX 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),分別為 Cχ26,Cχ29,CX30,CX32,CX36,CX37,CX40,CX43,CX45,CX46 及CX47[9]。目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中研究較多的為 CX32及CX43,CX43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最強(qiáng),主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞上[10],CX32在神經(jīng)系統(tǒng)分布最多,主要在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),同時(shí)在大腦皮質(zhì)、海馬的錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、中腦和基底節(jié)神經(jīng)元中也有較多的表達(dá)[11]。

        有研究表明,在癲癇發(fā)作敏感動(dòng)物的腦皮質(zhì)中,神經(jīng)元數(shù)目減少,而星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增加,體積變大,突觸增多,并且相鄰星形膠質(zhì)細(xì)胞之間GJ增多,與其相關(guān)的細(xì)胞因子也隨之發(fā)生變化。幾乎所有癲癇患者或動(dòng)物模型腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞,在形態(tài)、功能、數(shù)量上均有明顯改變。最近研究指出星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的生理功能,如神經(jīng)元的同步放電、離子平衡、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、葡萄糖的代謝和調(diào)節(jié)血管張力等[12,13]。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過縫隙連接相互偶聯(lián),能夠緩沖神經(jīng)元興奮時(shí)釋放到細(xì)胞外的大量K+,維持了神經(jīng)元細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定[14]?,F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明,功能失調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。CX43在星形膠質(zhì)細(xì)胞上分布最多,其形成的縫隙連接,在膠質(zhì)細(xì)胞間廣泛存在。在許多癲癇的研究中發(fā)現(xiàn),CX43表達(dá)上調(diào)及GJ偶聯(lián)增加,F(xiàn)onseca等觀察采用免疫熒光標(biāo)記的膠原纖維酸性蛋白(GFAP)以及應(yīng)用CX43抗體標(biāo)記癲癇患者和健康人海馬組織,發(fā)現(xiàn)癲癇患者海馬組織中,不但星形膠質(zhì)細(xì)胞間GJ偶聯(lián)進(jìn)一步擴(kuò)大,其CX43蛋白表達(dá)也明顯增加,提示上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞CX43的表達(dá)能夠進(jìn)一步加重全面性癲癇發(fā)作。且CX43的表達(dá)強(qiáng)度受癲癇持續(xù)時(shí)間的影響,癲癇時(shí)間愈長,CX43 的表達(dá)就愈多[15]。Nakase等[16]將敲除CX43基因的小鼠與CX43表達(dá)正常的小鼠在局灶性腦缺血后比較,發(fā)現(xiàn)CX43缺乏的小鼠凋亡細(xì)胞增多,表明GJ對凋亡有抑制作用。CX43可能與致癇后腦組織重塑有密切關(guān)系。由此我們可以推測星形膠質(zhì)細(xì)胞上的GJ參與了癲癇活動(dòng),CX43對癲癇的發(fā)展中起到一定作用。

        本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)及免疫電鏡方法對癲癇患者腦組織中CX43的表達(dá)進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組及對照組腦組織中均檢測到CX43的陽性細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組腦組織CX43陽性細(xì)胞數(shù)為(50.5±9.7),而對照組 CX43陽性細(xì)胞數(shù)為(12.0±7.0),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CX43在難治性癲癇致癇灶腦組織中的表達(dá)增加,提示縫隙連接參與了癲癇的發(fā)生及發(fā)展,在腦皮質(zhì)發(fā)育、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及環(huán)路的重組、神經(jīng)細(xì)胞間離子通道的構(gòu)成等方面發(fā)揮著重要作用。

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