孫 奎 吳曉明 張鴻霞 孫艷軍 許新華 王鶴鵬 楊景哲

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，河北 承德 067000)

絲裂霉素C對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

孫 奎 吳曉明 張鴻霞 孫艷軍 許新華 王鶴鵬 楊景哲

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，河北 承德 067000)

目的 研究絲裂霉素C(MMC)對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及Smad2/3蛋白的影響。方法 用組織塊法培養(yǎng)人瘢痕成纖維細(xì)胞，采用四唑鹽比色(MTT)方法，觀察不同濃度MMC對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的影響，采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)MMC作用下體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smad2/3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 不同濃度的MMC對(duì)體外培養(yǎng)的病理性瘢痕成纖維細(xì)胞活性的抑制呈時(shí)間和劑量依賴性。12.5 μg/ml MMC開始對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Smad2/3蛋白的表達(dá)具有明顯減弱效應(yīng)(P＜0.05)。結(jié)論 MMC一方面通過(guò)抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，另一方面通過(guò)抑制Smad2/3蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制瘢痕增生作用。

瘢痕疙瘩;成纖維細(xì)胞;絲裂霉素C;Smad2/3

瘢痕是皮膚損傷后組織修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)的瘢痕組織過(guò)度增生性病變，其發(fā)病機(jī)制和病因目前尚未完全闡明。本研究進(jìn)一步探討絲裂霉素C(MMC)MMC在瘢痕疙瘩治療中的作用機(jī)制，為MMC應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

分別取自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形科13例因瘢痕疙瘩入院進(jìn)行整形手術(shù)的患者，男9例、女4例，年齡55～64〔平均(59.6±3.4)〕歲。取材部位：上肢5例，面部3例，軀干5例，選取病程短且生長(zhǎng)活躍的瘢痕疙瘩組織，未接受任何抑制瘢痕增生的治療，均無(wú)系統(tǒng)性疾病史，且患者對(duì)所取組織用于實(shí)驗(yàn)知情同意。

1.2 成纖維細(xì)胞(FB)培養(yǎng)和分組

將手術(shù)切下的瘢痕疙瘩組織采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下切除表皮及皮下脂肪，將標(biāo)本制成1 mm2左右的組織塊，置于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)8～12 h。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d換液1次，2～3 w后，原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)FB 24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、MMC干預(yù)組，正常對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)液;MMC干預(yù)組中：MMC的終濃度分別為2.5、12.5、50、100、200 μg/ml。

1.3 MTT法測(cè)定瘢痕疙瘩FB的增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕4/ml疙瘩FB，用2.5 g/L胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至2×10，接種于3塊96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，根據(jù)分組不同更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，200 μl，每濃度復(fù)種8孔。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分別各孵育24、48、72 h后，向每孔內(nèi)加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒置顯微鏡下觀察 MTT結(jié)晶狀況，在酶標(biāo)儀下測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的光密度值，計(jì)算藥物作用于FB的生長(zhǎng)抑制率。抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A490值/正常對(duì)照組A490值)×100%。

1.4 Western印跡檢測(cè)Smad2/3蛋白

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕疙瘩FB，以5×105/ml接種于25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，CO2孵箱內(nèi)含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換含不同藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，徹底去除上清，加入適量細(xì)胞裂解液并加入PMSF(終 濃 度 為 0.174mg/ml)，冰 上 作 用 40min，12 000 r/min，4℃ 離心20 min，取上清，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。按比例(4∶1)加入5倍上樣緩沖液，封管，變性5 min，電泳，轉(zhuǎn)膜，2.5%封閉液配制抗體稀釋液，雜交，孵育，曝光，顯影、定影，圖像用Band Scan 4.5軟件掃描，得到目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值相比得到相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1體外瘢痕疙瘩FB的形態(tài)學(xué)觀察

體外瘢痕疙瘩FB原代培養(yǎng)成功后，培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不同的偽足，有一個(gè)較大的卵原形核，細(xì)胞界限清楚，開始單個(gè)細(xì)胞一般鋪展很開，細(xì)胞間排列疏松，有較大的細(xì)胞間隙，隨后細(xì)胞增多，則細(xì)胞相互平行排列，成群細(xì)胞呈漩渦狀或放射狀。見(jiàn)圖1。

2.2 2.5 μg/ml的MMC對(duì)瘢痕疙瘩FB增殖活性的影響

MMC即對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，這種抑制作用在200 μg/ml時(shí)達(dá)到最大，顯示出明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。在24、48、72 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，作用48、72 h與24 h相比，有極顯著差異(P＜0.01);作用72 h與48 h相比有上升趨勢(shì)，但差異不顯著。24 h為最佳作用時(shí)間，所用細(xì)胞在最大劑量和最長(zhǎng)時(shí)間藥物作用后均無(wú)壞死。見(jiàn)表1。

2.3 蛋白免疫印跡檢測(cè)Smad2/3蛋白的表達(dá)

正常對(duì)照組及MMC 2.5～200 μg/ml不同濃度組瘢痕疙瘩FB中Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 0.11±0.02，0.10±0.04，0.10±0.02，0.08±0.02，0.06±0.01，0.05±0.02。與正常對(duì)照組相比，50 μg/ml MMC對(duì)瘢痕疙瘩FB中Smad2/3蛋白的表達(dá)開始有減弱效應(yīng)(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 瘢痕疙瘩FB(HE，×200)

表1MMC對(duì)FB生長(zhǎng)的抑制率s，n=8，%)

表1MMC對(duì)FB生長(zhǎng)的抑制率s，n=8，%)

與正常對(duì)照組比較：1)P＜0.01;與24 h比較：2)P＜0.05，3)P＜0.01;與48 h比較：4)P ＜0.01;與72 h比較：5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

組別24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組0.00 0.00 0.00 MMC 2.5 μg/ml組 12.20±9.071)4)5) 38.04±9.371)2) 32.99±14.631)2)12.5 μg/ml組15.71±6.111)4)5) 44.29±9.851)2) 41.84±8.511)3)50 μg/ml組 29.58±4.341)4)5) 45.57±9.581)2) 47.81±10.241)2)100 μg/ml組 41.59±7.511)4)5) 55.26± 6.321) 52.42±10.631)3)200 μg/ml組 46.96±5.931)6) 53.37± 8.231) 58.07±7.301)3)

圖2 各組Smad2/3蛋白的表達(dá)

3 討論

瘢痕組織內(nèi)最主要的功能細(xì)胞FB過(guò)度增殖、膠原大量沉積是瘢痕形成過(guò)程的重要因素，其形成與遺傳、免疫、細(xì)胞因子等諸多因素有關(guān)〔1〕。

MMC是由頭狀鏈霉菌分離出來(lái)的抗腫瘤抗生素，還是一種強(qiáng)有力的抑制FB增殖的藥物，在耳鼻喉科、眼科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域治療瘢痕應(yīng)用比較廣泛。MMC能抑制細(xì)胞DNA合成，抑制DNA交聯(lián)的程度與鳥嘌呤、胞嘧啶呈正比，主要作用于細(xì)胞周期中G1晚期和S期〔2〕。目前認(rèn)為，MMC對(duì)于FB增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，是氟尿嘧啶的100倍，并有時(shí)間依從性，作用時(shí)間可達(dá)到無(wú)限期抑制增生，同時(shí)與劑量密切相關(guān)，大劑量時(shí)可以成為不可逆性抑制〔3〕。有研究表明，手術(shù)切除瘢痕疙瘩后，局部使用MMC可取得滿意的臨床效果〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)〔5〕結(jié)果一致，表明MMC對(duì)瘢痕疙瘩FB細(xì)胞增殖有抑制作用。

Smad家族作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，Smad蛋白分成R-Smad、Co-Smad和I-Smad 3個(gè)亞家族〔6〕。屬于Smad4共同通路型不能與TGF-β受體相互作用，但它可以與磷酸化的R-Smads相互作用形成穩(wěn)定的異源三聚體〔7〕。TGF-β是通過(guò)正、負(fù)反饋的調(diào)節(jié)通路自我調(diào)控，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)始于TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體形成異源二聚體，激活的TGF-βⅠ型受體使Smad2和/或Smad3磷酸化，R-Smads分子與Co-Smad形成異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與TGF-β誘導(dǎo)基因的特定序列直接結(jié)合，或通過(guò)與其他核蛋白的相互作用間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)內(nèi)源性TGF-β的表達(dá)，放大信號(hào)，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路;同時(shí)，磷酸化的Smad2，3激活Smad7啟動(dòng)子，上調(diào)Smad7表達(dá)，后者通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)TGF-βⅠ型受體而抑制受體蛋白激酶對(duì) R-Smad(Smad2，3)的磷酸化，抑制信號(hào)傳遞〔8〕，形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。由于MMC增加Smad7蛋白的表達(dá)，使其從細(xì)胞核移到胞質(zhì)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)TGF-β1型受體而抑制受體蛋白激酶對(duì)R-Smad(Smad2，3)的磷酸化，抑制TGF-β的病理性作用，使FB增殖受阻而發(fā)揮作用。

綜上，MMC對(duì)體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩FB具有抑制功能，但對(duì)于其治療不同類型瘢痕的具體使用方法、劑量以及副作用還有待進(jìn)一步研究。

1 Jagadeesan J，Bayat A.Transforming growth factor beta(TGFbeta)and keloid disease〔J〕.Int J Surg，2007;5(4)：278-85.

2 Liou SH，Chen YH，Loh CH，et al.The association between frequencies of mitomycin C-induced sister chromatid exchange and cancer risk in arseniasis〔J〕.Toxicol Lett，2002;129(3)：237-43.

3 Cincik H，Gungor A，Cekin E，et al.Effects of topical application of mitomycin C and 5-fluorouracil on myringotomy in rats〔J〕.Oncol Neurol，2005;26(3)：351-4.

4 Stewart CE IV，Kim JY.Application of mitomycin-C for head and neck keloids〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg，2006;135(6)：946-50.

5 郭永紅，羅金燕.TGF-β超家族與Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2005;11(8)：685-8.

6 Heldin C H，Miyazono K，Dijke P.TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins〔J〕.Nature，1997;390(6659)：465-71.

7 Attisano L，Wrana JL.Signal transduction by the TGF-beta superfamily〔J〕.Science，2002;296(5573)：1646-164.

8 Itoh S，Dijke PT.Negative regulation of TGF-beta receptor/Smad signal transduction〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2007;19(2)：176-84.

Effects of mitomycin C on cell proliferation and Smad2/3 expression of keloid fibroblasts

SUN Kui，WU Xiao-Ming，ZHANG Hong-Xia，et al.
Chengde Medical College Affiliated Hospital，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To study the influence of mitomycin C(MMC)on cell proliferation and Smad2/3 expression of keloid fibroblasts.Methods People scar fibroblasts were cultivated by tissue block method.The influence of different concentrations of MMC on cell proliferation activity was observed by MTT.Smad2/3 protein expression was measured by Western blot.Results Different concentrations of MMC restrained fibroblasts proliferation active with time and dose dependence.12.5 μg/ml MMC began to decrease Smad2/3 protein expression(P＜0.05).Conclusions MMC inhibits keloid formation by inhibiting fibroblasts proliferation and decreasing Smad2/3 protein expression.

Keloid;Fibroblasts;Mitomycin C;Smad2/3

R619+.6

A

1005-9202(2012)23-5215-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.051

吳曉明(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事燒傷、整形專業(yè)研究。

孫 奎(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事燒傷、整形專業(yè)研究。

〔2012-02-10收稿 2012-05-20修回〕

(編輯 徐 杰)