袁丹妮 李洪秀 王鵬

BMSCs在體外環(huán)境下可以分化為肝細(xì)胞系。此外，MSCs存在于骨髓，具有供源豐富、易于獲得、有自體供源、避免免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)。骨髓源的MSCs是較為理想的肝干細(xì)胞來源。本實(shí)驗(yàn)以HGF和EGF作為誘導(dǎo)分化劑，在體外誘導(dǎo)大鼠源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化，并檢測(cè)其分化率。試圖為肝細(xì)胞移植找到新的種子細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠8只，(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的取材、分離及培養(yǎng) ①10%水合氯醛腹腔注射麻醉致死大鼠，無菌條件下取出雙側(cè)股骨，剔除骨表面肌肉和骨膜，剪去兩骺端暴露髓腔。②用D-HANK'S液沖洗髓腔至沖洗液澄清，輕輕吹打沖洗液，用200目鋼網(wǎng)過濾掉大的團(tuán)塊后收集，1000rpm離心8 min;棄上清，用DMEM培養(yǎng)基(含15%FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)重懸細(xì)胞。③顯微鏡下計(jì)數(shù)后，以1×105/ml密度接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，置恒溫孵箱(37℃，5%CO2飽和濕度)培養(yǎng);48 h后全量換液。以后每周換液兩次。等細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的80%～90%時(shí)，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.2.2 誘導(dǎo)方法 取傳至2代的大鼠BMSCs，常規(guī)消化后，取1 ml 1×104/ml細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中(孔中預(yù)先放置無菌蓋玻片)，待細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合狀態(tài)(約占瓶底80%)時(shí)，棄除培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液 1 ml，置于恒溫孵箱(37℃、5%CO2)內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)。在此過程中，用倒置顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。各組在誘導(dǎo)第7、Zdl行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。擬行誘導(dǎo)分化的BMSCs，培養(yǎng)基中均不加防止細(xì)胞分化的LIF。

1.2.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 接種于6孔板內(nèi)細(xì)胞達(dá)到誘導(dǎo)時(shí)間后，行ABC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。一抗為兔抗大鼠AFP(1∶320)、兔抗大鼠 CK18(1∶1400)，未分化組為陰性對(duì)照。免疫組化陽性為胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)特征原代培養(yǎng)24 h內(nèi)即可觀察到在大量懸浮小圓形細(xì)胞之間出現(xiàn)呈梭形、菱形、三角形的細(xì)胞，這些細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。第一次換液后，小圓形細(xì)胞數(shù)量明顯減少，貼壁細(xì)胞增殖加快，形態(tài)漸趨一致，呈長(zhǎng)梭形。培養(yǎng)7～9 d，貼壁細(xì)胞就可以鋪滿培養(yǎng)瓶底的90%以上。

2.2 誘導(dǎo)BMSCs的效應(yīng)

2.2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果 BMSCs體外誘導(dǎo)過程的形態(tài)學(xué)觀察BMSCs在大多呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞樣的梭型或成纖維細(xì)胞樣長(zhǎng)條形，貼壁較緊，有克隆形成，平均9～11 d長(zhǎng)滿板底或培養(yǎng)瓶底。加入各種誘導(dǎo)成分，梭形或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，變成紡錘、不規(guī)則圓形或多角形，細(xì)胞數(shù)量逐漸變多，形似肝細(xì)胞。

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色及圖像分析結(jié)果 在誘導(dǎo)分化第7、21天進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，A組細(xì)胞AFP、CK18均為陰性著色，而B、C、D、E組細(xì)胞AFP和CK18均為陽性著色。對(duì)各組細(xì)胞染色進(jìn)行圖像分析，每組細(xì)胞取4張切片，每張切片取5個(gè)視野，進(jìn)行圖像分析，并計(jì)算出各組細(xì)胞的陽性染色率P(U值)，結(jié)果如下表。(表2，3)

表2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色AFP染色陽性率(PU值，，n=4)

表2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色AFP染色陽性率(PU值，，n=4)

注:1.A組:陰性對(duì)照組。B組:HGF組。C組:EGF組。D組:HGF+EGF組;2.7 d與21 d之間差異有顯著性意義(F=8.740，P=0.006)。以21 d測(cè)得的PU值較高;3.各處理組之間差異有顯著性意義(F=151.374，P=0.000)。兩兩比較差異均有顯著性意義(P=000)，D組誘導(dǎo)分化的效果最好，B組次之，C組較差;4.處理組與時(shí)間無交互效應(yīng)(F=0.492，P=0.742)。

組別 7 d 21 d 合計(jì)A組34.00±22.30 39.35±24.51 36.672±3.29 2.36±1.87 4.20±3.29 3.28±2.67 B組 35.24±6.02 39.61±7.89 37.43±6.90 C組 21.68±6.37 25.73±4.90 23.71±5.69 D組 46.37±5.73 55.11±5.01 50.74±6.83合計(jì)

表3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色CK18染色陽性率(PU值，，n=4)

表3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色CK18染色陽性率(PU值，，n=4)

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3 討論

本研究在誘導(dǎo)大鼠BMSCs向肝樣細(xì)胞分化過程中采用了HGF、EGF-4，HGF是一完全有絲分裂原，主要在肝臟Kupffer細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，最初是作為肝細(xì)胞的一種潛在的有絲分裂原而被發(fā)現(xiàn)和克隆的，它是一種普遍存在并具有多能性的細(xì)胞因子，通過與受體 c-met相互作用而對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生促有絲分裂及促形態(tài)形成作用，使運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，其受體c-met是一種膜外部分擁有酪氨酸激酶的跨膜蛋白，對(duì)具有c-met表達(dá)的多種細(xì)胞的有絲分裂及塑形都具有刺激作用［1，2］。

我們選擇的HGF和EGF以及HGF+EGF作為誘導(dǎo)因子，在加入誘導(dǎo)因子后第7～21天進(jìn)行細(xì)胞爬片，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)肝細(xì)胞標(biāo)志AFP和CK18，并應(yīng)用圖像分析的方法計(jì)算BMSCs的分化比率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化第7～21天免疫細(xì)胞化學(xué)染色各誘導(dǎo)組均可檢測(cè)出AFP和CK18表達(dá)，以HGF+EGF聯(lián)合誘導(dǎo)分化BMSCs的陽性率最高，HGF次之，EGF則較弱。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HGF和EGF具有誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞分化的能力，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果證明二者聯(lián)合使用效果更佳。說明了骨髓BMSCs在HGF+EGF的定向誘導(dǎo)下可以更好地向肝樣細(xì)胞分化，為肝細(xì)胞工程的種子細(xì)胞來源提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Miller SA，Dykes DD，Polesky HP.A simple salting out procedure forextracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acids Res，1988，16:1215.

［2］Hayashi Sl，Watanabe J，Nakachi K，et al.PCR detection of an A/Gpolymorphism within exon 7 of the CYP1 A1 gene.Nucleic Acids Res，1991，19:4797.