于沈敏 慕小瑜 蔡兵 傅隼 李敏 姚龔

目前臨床上用于ACL損傷重建的移植物基本上分為自體移植物、同種異體移植物和人工韌帶三種，有骨-髕腱-骨、LARS韌帶、自體半腱肌、股薄肌腱移植等。我們通過復(fù)合滌綸氈型人工韌帶替代家犬膝關(guān)節(jié)ACL的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)滌綸氈型韌帶在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的組織學(xué)演變和生物力學(xué)特性進(jìn)行分析，探討其臨床應(yīng)用的可行性。

1 資料與方法

1.1 材料 選擇復(fù)合滌綸氈型韌帶(由黃浦區(qū)中心醫(yī)院骨科和上海市胸科醫(yī)院契斯特醫(yī)療科技公司共同研制生產(chǎn)，經(jīng)γ射線消毒)是以氈型結(jié)構(gòu)為特征，由滌綸機(jī)織結(jié)構(gòu)與氈體復(fù)合而成，規(guī)格為8 cm×1.0 cm。將人工韌帶分為2組進(jìn)行力學(xué)測(cè)試:植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組和未植入組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)準(zhǔn)米格爾犬12只(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供及飼養(yǎng))，采用速眠新0.5 ml/kg、鹽酸氯胺酮2 mg/kg復(fù)合麻醉。12只犬手術(shù)側(cè)肢體均為右后側(cè)膝關(guān)節(jié)，常規(guī)消毒鋪巾后，取前外側(cè)切口暴露關(guān)節(jié)腔，切除ACL后經(jīng)ACL脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)止點(diǎn)向股骨外髁止點(diǎn)鉆孔，將氈型韌帶卷成與犬ACL直徑相當(dāng)?shù)膱A柱體植入，伸膝位適當(dāng)張力下旋入擠壓螺釘固定脛骨端和股骨端，擰入時(shí)要保持移植物持續(xù)的張力，避免移植物失去應(yīng)有的張力影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分別于術(shù)后6、9、12周處死，取關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶部分、關(guān)節(jié)滑膜、脛骨近端骨隧道及股骨隧道部分韌帶標(biāo)本做組織學(xué)觀察。

1.3 觀察方法 ①形態(tài)學(xué)觀察:術(shù)后6、9、12周犬右后側(cè)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度及標(biāo)本大體形態(tài)、與周圍組織粘連情況。②光鏡觀察:標(biāo)本用10%甲醛固定，采用石臘包埋法，沿吻合區(qū)形態(tài)兩端的長(zhǎng)軸縱向切片。③電鏡觀察:標(biāo)本用2%戊二醛溶液前固定，鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂816包埋，超薄切片。④力學(xué)強(qiáng)度測(cè)試:股骨-人工韌帶-脛骨標(biāo)本鹽水保持濕潤(rùn)，放置于WE-5A型液壓萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上，用數(shù)字試應(yīng)變儀(YJ-14)讀取應(yīng)變，加載速率為60 mm/min，并與未植入的復(fù)合滌綸氈型人工韌帶做對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后6周實(shí)驗(yàn)犬右后側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹消退，屈曲30°位跛行，9周后膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度為伸15°～屈曲60°，12周后關(guān)節(jié)可伸直。術(shù)后6周見關(guān)節(jié)腔內(nèi)及韌帶表面有滑膜組織長(zhǎng)入，韌帶入骨隧道口處滌綸纖維絲表面稍粗糙。術(shù)后9周見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量纖維滲出物，滌綸氈型韌帶表面與周圍組織存在粘連。術(shù)后12周見韌帶表面的滑膜組織覆蓋完整，骨隧道與關(guān)節(jié)內(nèi)交界處滌綸氈型韌帶已被滑膜及肉芽組織包裹。

2.2 光鏡觀察 術(shù)后6周滌綸氈型韌帶被纖維組織呈“島嶼”狀分隔，散在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，韌帶與周圍組織分界不清，HE染色顯示少量的膠原纖維深染，炎性細(xì)胞減少。術(shù)后9周“島嶼”狀分隔的纖維組織已相連接成片狀，完全充填韌帶的微孔，韌帶周邊出現(xiàn)膠原帶。HE染色顯示成熟的膠原纖維數(shù)量明顯增多，已無(wú)炎性細(xì)胞和異物巨細(xì)胞。術(shù)后12周HE染色顯示韌帶微孔內(nèi)及周邊的膠原化區(qū)域較9周時(shí)更加均勻致密，韌帶周圍的膠原帶與伸入韌帶中間的膠原化纖維組織連接成片狀，盲區(qū)逐漸縮小直至消失。

2.3 電鏡觀察 術(shù)后6周見細(xì)胞腫脹消退，核染色質(zhì)濃聚，肌纖維中明暗相間的帶狀結(jié)構(gòu)排列整齊。術(shù)后9周膠原纖維密集，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后12周氈型韌帶內(nèi)有小動(dòng)脈形成，可見動(dòng)脈壁的平滑肌纖維及內(nèi)皮細(xì)胞，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)，韌帶四周有正常結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞形成，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。

2.4 生物力學(xué)測(cè)定 術(shù)前測(cè)定復(fù)合滌綸氈型韌帶的極限載荷為1390N，植入術(shù)后12周時(shí)的極限承載能力為1630N。術(shù)后12周時(shí)的最大抗拉張強(qiáng)度與未植入的韌帶相比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)法，二者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后6、9、12周樣本的抗拉強(qiáng)度值見表1。

圖1 術(shù)后6周“盲區(qū)”消失，纖維肉芽組織充填氈型微孔，炎性細(xì)胞減少

圖2 術(shù)后9周“盲區(qū)”被纖維組織替代，膠原纖維增多、致密

圖3 術(shù)后12周氈型韌帶內(nèi)膠原化趨勢(shì)，膠原化的纖維組織

表1 術(shù)后6、9、12周樣本與對(duì)照組的抗拉強(qiáng)度值(牛頓)

3 討論

3.1 生物相容性評(píng)價(jià) ACL損傷重建后，移植物要經(jīng)歷細(xì)胞增生、再血管化和細(xì)胞新生以及新生組織重塑的過程［1］。早期的滌綸韌帶由中央4股滌綸帶包繞其外的滌綸網(wǎng)組成，抗?fàn)繌?、耐磨損，利于纖維組織長(zhǎng)入，但臨床應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)有40%的關(guān)節(jié)滑膜炎［2］。我們實(shí)驗(yàn)所用的復(fù)合滌綸氈型韌帶由上下兩層滌綸氈型結(jié)構(gòu)和中央滌綸機(jī)織結(jié)構(gòu)組成，氈型結(jié)構(gòu)材料為聚酯纖維(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)，具有更好的生物相容性，在生物體內(nèi)可長(zhǎng)期保持力學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)隋性［2］。氈型韌帶具有良好的柔順性，作為一種支架材料，其富于孔隙的網(wǎng)狀構(gòu)造有利于組織長(zhǎng)入和愈合，形成材料-細(xì)胞組織復(fù)合體，細(xì)胞親和性好，無(wú)細(xì)胞毒性。同時(shí)提供了相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并且韌帶纖維間因有組織長(zhǎng)入而減少了摩擦，減少了磨損。光鏡顯示植入早期纖維結(jié)締組織由四周長(zhǎng)入韌帶，伴有淋巴細(xì)胞，嗜酸性白細(xì)胞及異物巨細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，韌帶周圍及微孔內(nèi)被膠原化的稠密纖維組織所充填，炎性細(xì)胞和異物巨細(xì)胞消失。韌帶表面光滑，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)后9周見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量纖維滲出物，氈型韌帶表面與周圍組織存在粘連，影響關(guān)節(jié)活動(dòng)度。隨著活動(dòng)度增加，術(shù)后12周見韌帶表面被膠原組織包裹，與周圍組織間粘連消失。纖維膜形成后，滌綸氈型韌帶對(duì)關(guān)節(jié)囊的刺激就減輕了。

3.2 滌綸氈型韌帶植入后的力學(xué)變化 曾有作者采用滌綸氈片修復(fù)陳舊性跟腱斷裂和重建喙鎖韌帶、環(huán)狀韌帶等，取得滿意療效，術(shù)后隨訪未出現(xiàn)韌帶斷裂［3］。在其基礎(chǔ)上重新編織生產(chǎn)的復(fù)合滌綸氈型韌帶抗拉強(qiáng)度≥1200牛頓，植入早期見其周圍組織細(xì)胞水腫，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹明顯。隨著植入時(shí)間延長(zhǎng)，各細(xì)胞器腫脹消退，成纖維細(xì)胞不斷成熟，核深染成為纖維細(xì)胞，生成膠原纖維。氈型韌帶內(nèi)有血管生長(zhǎng)，使人工韌帶抗拉強(qiáng)度不隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)力學(xué)衰減。羅軼等測(cè)試新鮮尸體的ACL的力學(xué)性能，發(fā)現(xiàn)人體ACL最大極限載荷為(870±65)N，載荷大于上述值后韌帶開始撕裂［4］。而復(fù)合滌綸氈型韌帶術(shù)前測(cè)定的極限載荷為1390 N，植入術(shù)后12周時(shí)的極限載荷為1630 N，均大于新鮮尸體的測(cè)得值。兩者相比，術(shù)后12周的韌帶抗拉強(qiáng)度比術(shù)前值更高，說明有組織長(zhǎng)入的滌綸氈型韌帶比無(wú)組織長(zhǎng)入的韌帶具有更好的力學(xué)性能。其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為支架有利于誘導(dǎo)纖維組織長(zhǎng)入，為韌帶血管化和再生創(chuàng)造條件［5］。

滌綸氈型韌帶臨床應(yīng)用前景良好，但其抗疲勞強(qiáng)度和抗張力性能仍需要加強(qiáng)。理想的人工韌帶應(yīng)具有永久生物替代性，但至今沒有任何一種材料獲得成功，因此爭(zhēng)取滌綸氈型韌帶與受體達(dá)到生物性融合是我們今后研究的目標(biāo)。

［1］Yoshiya S，Nagano M，Kurosaka M，et al.Graft healing in the bone tunnel in reconstruction J.Clin Orthop，2000，376:278-86.

［2］張?chǎng)?人工合成材料重建后交叉韌帶研究進(jìn)展.中國(guó)骨傷，2007，20(2):142-144.

［3］Ge Z，Goh JC，Wang L，et al.Characterization of knitted polymeric scaffolds for potential use in ligament tissue engineering.Biomater Sci Polym Ed，2005，16(9):1179-1192.

［4］羅軼，彭永岳，陳偉兵，等.不同方法移植重建膝前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)研究.中華骨科雜志，2006，8(3):243-244.

［5］慕小瑜，官眾，李洪，等.滌綸氈片重建喙鎖韌帶治療陳舊性肩鎖關(guān)節(jié)脫位.中華外科雜志，1997，35(12):752.