王 利
咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北咸寧 437100
氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制
王 利
咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北咸寧 437100
目的 對氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制進行研究。方法 培養(yǎng)人乳癌細胞株MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A,MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后,采集細胞。結(jié)果 氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用,對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。細胞內(nèi)DiOC6熒光強度隨著氧化蘇木素含量增加而降低。氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。 結(jié)論 氧化蘇木素能誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡,其作用機制可能是survivin蛋白的表達降低。
氧化蘇木素;人乳癌MCF-7;細胞凋亡
乳腺癌是女性常見腫瘤疾病,嚴重危害女性的身體健康,目前,治療乳癌有很大改觀,但仍有一定局限性,所以尋找新的治療方法是當今研究目標。筆者采用具有縮血管、中樞神經(jīng)細胞的缺血保護及抗炎功效的氧化蘇木素,觀察人乳癌MCF-7細胞,研究其是否有抗腫瘤活性及其作用機制。
四氮唑藍MTT、DiOC、鏈霉素及青霉素(上海化學(xué)試劑廠),DMEM培養(yǎng)基、超級新生小牛血清(天津灝洋生物技術(shù)有限公司),DMSO (Gibeo公司),AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒、細胞色素C、caspase-9、survivin及GAPDH抗體(南京凱基生物公司)。3550自動酶聯(lián)免疫檢測儀、FC500流式細胞儀均為美國Beckman公司產(chǎn)品。
在37℃體積分數(shù)5%CO2下將人乳癌細胞株 MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A在10%小牛牛血清與青鏈霉素(100U/mL和100μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后,采集細胞,按照試劑盒說明于PBS緩沖液中對每個樣品10000個細胞進行檢測,凋亡細胞為AnnexinV與PI雙陽性、AnnexinV陽性的細胞。檢測線粒體膜電位高低。1×SDS上樣緩沖液裂解細胞提取總蛋白,內(nèi)參照顯示相同的上樣量為GAPDH蛋白。對細胞漿中細胞色素C進行采集,將GAPDH蛋白作為細胞漿蛋白的內(nèi)參照。
采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,計數(shù)資料采t檢驗,計量型數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)檢驗,計量資料采用χ2檢驗,以P<0.05,為有顯著差異性,提示有統(tǒng)計學(xué)意義。
①MTT結(jié)果顯示,氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用,對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱,兩組比較,P<0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義,詳情見表1。采用AnnexinV/PI雙染法檢測不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞的影響,MCF-7細胞處理48h后,細胞凋亡率見表2。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。
表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結(jié)果(±s)
表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結(jié)果(±s)
組別 IC50(μmol/L)MCF-7細胞MCF 10A細胞7.23±0.65 33.86±2.97
表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響(±s)
表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響(±s)
氧化蘇木素(μmol/L) MCF-7細胞凋亡率(%)0 7.5 15 30 3.42±0.68 17.23±1.33 31.58±4.45 51.56±5.79
②采用DiOC6檢測氧化蘇木素檢測對線粒體膜電位的影響,0、7.5、15、30μmol/L 氧化蘇木素處理細胞 48h 后,細胞內(nèi)DiOC6 熒光強度分別為(11.62±0.61)、(9.86±0.70)、(8.53±0.65)、(8.05±0.45)。
③氧化蘇木素對細胞處理48h后,細胞漿內(nèi)細胞色素C有劑量依賴性提高趨勢,caspase-9裂解帶出現(xiàn)在蛋白免疫印跡檢測中,說明釋放進細胞漿內(nèi)的細胞色素C剪切下游的caspase-9,激活的caspase-9可造成線粒體通路凋亡。
④氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。
目前,抗乳腺癌藥物有很多種,但是腫瘤多藥、耐藥的產(chǎn)生對治療產(chǎn)生很大影響,大多數(shù)藥物還有較嚴重的副作用,所以新的抗癌藥物研發(fā)是治療乳腺癌的有效途徑[2]。本研究是對蘇木提取物中分離的一個單體成分氧化蘇木素進行研究,結(jié)果顯示,氧化蘇木素有較高效的抗腫瘤活性。氧化蘇木素對MCF-7細胞的細胞毒作用明顯高于其對MCF 10A細胞細胞毒作用,兩組比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),所以需對氧化蘇木素抗人乳癌細胞作用機制進行更深一步探討。AnnexinV/PI雙染法凋亡檢測是一種具有高特異性及強敏感性的檢測方法,細胞凋亡初期細胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸可外翻到細胞外與對其有高度親和力的蛋白AnnexinV結(jié)合,AnnexinV單陽性的細胞出現(xiàn),在細胞膜嚴重破損的細胞凋亡晚期,PI可進入細胞里,AnnexinV與PI雙陽性細胞出現(xiàn)。線粒體途徑與死亡受體途徑是細胞凋亡的主要通路。
綜上所訴,氧化蘇木素能通過線粒體通路誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡,氧化蘇木素可劑量依賴性下調(diào)survivin蛋白的表達,下調(diào)survivin可能是其誘發(fā)線粒體凋亡通路的主要機制。
[1]佟俊杰,張廣耘,袁曉.胞凋亡檢測方法的研究進展[J].口腔醫(yī)學(xué),2010(7):59-61.
R711
A
1672-5654(2012)07(b)-0163-01
2012-06-19)