王 利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制

王 利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

目的 對氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制進行研究。方法 培養(yǎng)人乳癌細胞株MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A，MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細胞。結(jié)果 氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用，對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。細胞內(nèi)DiOC6熒光強度隨著氧化蘇木素含量增加而降低。氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。 結(jié)論 氧化蘇木素能誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，其作用機制可能是survivin蛋白的表達降低。

氧化蘇木素；人乳癌MCF-7；細胞凋亡

乳腺癌是女性常見腫瘤疾病，嚴重危害女性的身體健康，目前，治療乳癌有很大改觀，但仍有一定局限性，所以尋找新的治療方法是當今研究目標。筆者采用具有縮血管、中樞神經(jīng)細胞的缺血保護及抗炎功效的氧化蘇木素，觀察人乳癌MCF-7細胞，研究其是否有抗腫瘤活性及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

四氮唑藍MTT、DiOC、鏈霉素及青霉素（上海化學(xué)試劑廠），DMEM培養(yǎng)基、超級新生小牛血清（天津灝洋生物技術(shù)有限公司），DMSO （Gibeo公司），AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒、細胞色素C、caspase-9、survivin及GAPDH抗體(南京凱基生物公司)。3550自動酶聯(lián)免疫檢測儀、FC500流式細胞儀均為美國Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

在37℃體積分數(shù)5%CO2下將人乳癌細胞株 MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A在10%小牛牛血清與青鏈霉素（100U/mL和100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細胞，按照試劑盒說明于PBS緩沖液中對每個樣品10000個細胞進行檢測，凋亡細胞為AnnexinV與PI雙陽性、AnnexinV陽性的細胞。檢測線粒體膜電位高低。1×SDS上樣緩沖液裂解細胞提取總蛋白，內(nèi)參照顯示相同的上樣量為GAPDH蛋白。對細胞漿中細胞色素C進行采集，將GAPDH蛋白作為細胞漿蛋白的內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采t檢驗，計量型數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）檢驗，計量資料采用χ2檢驗，以P＜0.05，為有顯著差異性，提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

①MTT結(jié)果顯示，氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用，對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱，兩組比較，P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，詳情見表1。采用AnnexinV/PI雙染法檢測不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞的影響，MCF-7細胞處理48h后，細胞凋亡率見表2。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。

表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結(jié)果（±s）

表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結(jié)果（±s）

組別 IC50（μmol/L）MCF-7細胞MCF 10A細胞7.23±0.65 33.86±2.97

表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響（±s）

表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響（±s）

氧化蘇木素（μmol/L） MCF-7細胞凋亡率（%）0 7.5 15 30 3.42±0.68 17.23±1.33 31.58±4.45 51.56±5.79

②采用DiOC6檢測氧化蘇木素檢測對線粒體膜電位的影響，0、7.5、15、30μmol/L 氧化蘇木素處理細胞 48h 后，細胞內(nèi)DiOC6 熒光強度分別為（11.62±0.61）、（9.86±0.70）、（8.53±0.65）、（8.05±0.45）。

③氧化蘇木素對細胞處理48h后，細胞漿內(nèi)細胞色素C有劑量依賴性提高趨勢，caspase-9裂解帶出現(xiàn)在蛋白免疫印跡檢測中，說明釋放進細胞漿內(nèi)的細胞色素C剪切下游的caspase-9，激活的caspase-9可造成線粒體通路凋亡。

④氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。

3 討論

目前，抗乳腺癌藥物有很多種，但是腫瘤多藥、耐藥的產(chǎn)生對治療產(chǎn)生很大影響，大多數(shù)藥物還有較嚴重的副作用，所以新的抗癌藥物研發(fā)是治療乳腺癌的有效途徑[2]。本研究是對蘇木提取物中分離的一個單體成分氧化蘇木素進行研究，結(jié)果顯示，氧化蘇木素有較高效的抗腫瘤活性。氧化蘇木素對MCF-7細胞的細胞毒作用明顯高于其對MCF 10A細胞細胞毒作用，兩組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），所以需對氧化蘇木素抗人乳癌細胞作用機制進行更深一步探討。AnnexinV/PI雙染法凋亡檢測是一種具有高特異性及強敏感性的檢測方法，細胞凋亡初期細胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸可外翻到細胞外與對其有高度親和力的蛋白AnnexinV結(jié)合，AnnexinV單陽性的細胞出現(xiàn)，在細胞膜嚴重破損的細胞凋亡晚期，PI可進入細胞里，AnnexinV與PI雙陽性細胞出現(xiàn)。線粒體途徑與死亡受體途徑是細胞凋亡的主要通路。

綜上所訴，氧化蘇木素能通過線粒體通路誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，氧化蘇木素可劑量依賴性下調(diào)survivin蛋白的表達，下調(diào)survivin可能是其誘發(fā)線粒體凋亡通路的主要機制。

[1]佟俊杰,張廣耘,袁曉.胞凋亡檢測方法的研究進展[J].口腔醫(yī)學(xué),2010(7)：59-61.

R711

A

1672-5654（2012）07（b）-0163-01

2012-06-19)