李招云 張黎明 王 攀 朱 杰 范廣明 沈景豐*

（浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000）

子宮頸癌（SCC ）是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，國際上，SCC處于婦女惡性腫瘤的第二位，每年約25萬人死于SCC。我國SCC患病率和病死率均占世界1/3，每年新發(fā)病例9萬左右，且患者年齡有年輕化上升趨勢[1]。SCC是可預(yù)防和治愈的，早期篩查和定期復(fù)查，積極處理癌前病變，可阻斷病程，預(yù)防SCC，特別是宮頸癌浸潤癌的發(fā)生。我國目前篩查SCC宮頸癌的主要方法是TCT檢查及HPV檢測，但在臨床上的應(yīng)用均存在一定的局限性，近年研究人員一直在尋求一種新的跟準(zhǔn)確的指標(biāo)，以提高篩查力度。非整倍體染色體是癌細(xì)胞普遍存在的遺傳學(xué)特征之一，現(xiàn)代細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物研究表明，人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)出染色體不穩(wěn)定導(dǎo)致的非整倍體，染色體的不穩(wěn)定性可致端粒酶功能異常的發(fā)生[2]，端粒酶功能異常就可使正常細(xì)胞獲得腫瘤細(xì)胞的“不死性”。SCC染色體研究顯示，該腫瘤細(xì)胞3號染色體位點(diǎn)遺傳呈不穩(wěn)定性，多為3q26～3q27拷貝數(shù)增加[3,4]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SCC拷貝數(shù)增加明顯高于重度不典型增生，據(jù)此推測此區(qū)域可能存在SCC發(fā)生的致病基因[5,6]。本研究用熒光原位雜交方法檢測正常宮頸細(xì)胞、CIN宮頸上皮及SCC腫瘤細(xì)胞中hTERC基因的異常擴(kuò)增，以探討hTERC基因的異常擴(kuò)增與SCC發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)系，為臨床SCC篩查、診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象

選擇臺(tái)州市中心醫(yī)院2008年6月至2010年12月門診收集的經(jīng)宮頸脫落細(xì)胞液基細(xì)胞學(xué)檢查正常女性45名，宮頸異常病變患者208例，年齡18～65歲，平均年齡42歲。208例宮頸脫落細(xì)胞液基細(xì)胞學(xué)減產(chǎn)異?；颊呔嘘幍犁R檢查及病理活檢一一明確診斷。同時(shí)，按伯波塞斯達(dá)系統(tǒng)分類法將其分為宮頸脫落細(xì)胞液基細(xì)胞學(xué)檢測正常組（簡稱“正常組”）45名、ASC組41例、LSLL組115例、HSLL組21例和SCC組31例。208例TCT檢查ASC以上異?；颊咴陉幍犁R下行病理活檢，確定為炎癥或濕疣組34例 、CIN1～3期3組共148例、SCC組26例。表1 臺(tái)州市中心醫(yī)院依據(jù)中國病理學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)對受試者進(jìn)行巴氏涂片、病理學(xué)診斷與TCT細(xì)胞形態(tài)學(xué)所得結(jié)果之間的對照。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞標(biāo)本的采集

表1 巴氏涂片、病理學(xué)診斷與TCT細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果之間的對照

TCT子宮頸刷在宮頸口鱗柱上皮交界處取細(xì)胞標(biāo)本，并置TCT保存液中。保存液中的宮頸懸浮細(xì)胞按照常規(guī)用于TCT檢查，剩余的用于FISH檢測。

1.2.2 制片

取TCT檢查剩液約10mL，1200×g離心10min，1×PBS洗滌兩遍后離心去除上清液；膠原酶B 5mL（1mg/mL）37℃水浴30min，再次離心。加入5mL去離子水，低滲重新吹打懸浮細(xì)胞。37℃水浴30min，加2mL固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）預(yù)固定5min。離心后棄上清液，再加上5mL固體液重復(fù)以上“固定、去除上清液的”步驟2次，用沉淀的細(xì)胞制備成一定濃度的溶液，將細(xì)胞滴于玻璃上，56℃烤片3h后推制細(xì)胞片。

1.2.3 FISH檢測hTERC基因

①探針：GIPTERC/CSP3DNA探針由北京菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供。將TERC DNA探針雜交到3號染色體長臂（3q26.3），熒光信號為綠色。②標(biāo)本片預(yù)處理：涂片置2×SSC洗脫2次，70%、85%和100%乙醇梯度脫水固定，自然干燥。③FISH操作步驟：避光環(huán)境中，10μL探針混合液（7μL雜交緩沖液、1μL去離子水和2μL探針）滴于雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片，橡皮膠封片，置于原味雜交儀（ThermoBriteTM）中76℃5min，42℃16h過液雜交，第2天將玻片洗脫，移去蓋玻片，在水浴溫度67℃下，玻片置2×SSC/0.3%NP-40溶液中1.5min，最后于70%乙醇溶液中10min脫水。玻片自然干燥后，加15μLDAPI（4，6-diamidino-2-phenylndole）復(fù)染液。用蓋玻片封好，放于暗盒中復(fù)染20min。

1.2.4 FISH信號的判斷

用OlympusB×51熒光顯微鏡在DAPI/FTTC/TRITC三色濾光鏡激發(fā)下觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號，用Video2.0公司提供的FISH分析軟件進(jìn)行圖像分析，評估整個(gè)涂片的CSP3和TERC基因雙色探針雜交情況，選擇細(xì)胞核狀態(tài)完整、雜交信號結(jié)果為綠：紅，正常細(xì)胞雜交信號為2∶2型，異常細(xì)胞信號包括2∶3、2∶4、2∶5、3∶3、3∶4、4∶5、5∶5、10∶10型等。從正常組中選20名健康人宮頸細(xì)胞玻片，各計(jì)數(shù)信號完整的100個(gè)細(xì)胞，記錄其中的異常細(xì)胞數(shù)、將TERC基因異常擴(kuò)散的臨界值定為（異常細(xì)胞χ—±3s）×100%，大于此值為TERC基因擴(kuò)增陽性。本試驗(yàn)臨界值為5.9%，取整數(shù)，將臨界值≥6定義為TERC基因擴(kuò)增異常。

表2 各組細(xì)胞涂片背景、細(xì)胞形態(tài)

表3 各組細(xì)胞涂片雜交信號

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間hTERC表達(dá)陽性率分析比較，采用行x列表資料和表資料的χ2檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同制片方式所得FISH雜交片在背景與細(xì)胞形態(tài)方面的比較

直接涂片26張；生理鹽水制片29張；TCT低滲制片44張。直接涂片法、生理鹽水法與TCT低滲法玻片背景清晰度分別為34.6%（9/26）、48.2%（14/29）和70.4%（31/44），各組之間有明顯差異（P＜0.05），其中以TCT低滲法最滿意。TCT低滲法高倍鏡下平均裸核細(xì)胞比例高于直接涂片法、生理鹽水法，差異有顯著性（P＜0.05）。見表2。

2.2 不同制片方式所得FISH雜交片在雜交信號方面的比較

TCT低滲法高倍鏡下無/少信號比例高于直接涂片法和鹽水制片法，差異有顯著性（P＜0.05）。直接涂片法、生理鹽水法高倍鏡下無/少信號比例無明顯差異（P＞0.05）。TCT低滲組雜交成功率與直接涂片法、生理鹽水法比較，差異有顯著性（P＜0.05）。見表3。

3.2 TCT分組的受試者FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增結(jié)果

TCT檢測45名正常涂片和異常涂片208例患者，經(jīng)FISH檢測，hTERC基因異常擴(kuò)增陽性率在正常組、ASC組、LSIL組、HSIL組、SCC組分別為2.2%（1/45）、4.8%（2/41）、73.0%（84/115）、95.2%（20/21）、100%（31/31）；ASC組明顯低于LSLL組和HSIL組（χ2=15.16、36.93，P均＜0.01）。見表4。提示FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率對宮頸病變的進(jìn)展趨勢有一定的預(yù)見性。

表4 TCT分組的受試者FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率

2.4 病理活檢分組的受試者FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增結(jié)果

病理活檢確定的253例受檢者中，經(jīng)FISH檢測，hTERC基因擴(kuò)增陽性率在正常者組、炎癥者組、CINⅠ組、CIN Ⅱ期組、CIN Ⅲ期組、SCC組分別為2.2%（1/45）、 4.8%（2/41）、 70.5%（31/44）、82.5%（33/40）、100%（21/21）、100%（31/31）。見表5。CINⅠ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組、SCC組與涂片正常比較，hTERC基因陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=132.38，P＜0.01）。其中CINⅠ期與CINⅡ期比較，CIN Ⅱ期與CIN Ⅲ期/SCC比較，均采用直接概率法檢驗(yàn)，結(jié)果顯示前者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04），而后者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.37），且隨組織學(xué)病變程度增加，hTERC基因擴(kuò)增陽性率增加。說明FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率在CINⅠ期組、CIN Ⅱ期組、CIN Ⅲ期組、SCC組效果更好。

表5 病理活檢分組的受試者FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增陽性率

2.5 hTERC基因拷貝數(shù)異常表現(xiàn)類型

我們共計(jì)數(shù)細(xì)胞39001個(gè)，其中異常細(xì)胞15763個(gè)，CIN組和SCC組患者中，hTERC基因異常雜交信號多樣化表現(xiàn)為CSP3：hTERC（綠信號：紅信號）為2∶3、2∶4、2∶5、3∶3、4∶4、5∶5、3∶6、3∶5、4∶8、10∶10等類型，其中前6種類型較為常見。各種類型受試者宮頸細(xì)胞FISH檢測的鏡下圖片及其宮頸異常病變患者h(yuǎn)TERC基因擴(kuò)增細(xì)胞雜交信號類型分布分別見圖1和表6。34例患者炎性細(xì)胞涂片中，異常細(xì)胞中2∶3型占63.8%；58例CINⅠ期患者涂片中，異常細(xì)胞中2∶3型占50.4%；47例CIN Ⅱ期患者涂片中，異常細(xì)胞中2∶3型僅占30.7%，較炎癥和CINⅠ期明顯下降（χ2=8.3，P＜0.05），但出現(xiàn)雙色＞3的多倍體比例明顯增高；43例CIN Ⅲ期涂片患者中異常細(xì)胞＞3的多倍體占90.1%，比CIN Ⅱ期中69.3%有明顯上升（χ2=24.1，P＜0.01）；26例SCC患者涂片中，異常細(xì)胞中＞3的多倍體占98.4%與CIN Ⅲ期的90.1%比較無明顯差別（χ2=2.1，P＞0.05），可見到隨著病變嚴(yán)重程度的增加，hTERC基因擴(kuò)增的拷貝數(shù)增加，并出現(xiàn)10∶10的多倍體。所有異常細(xì)胞中出現(xiàn)的多倍體一3∶3型最常見，在CINⅠ期、CIN Ⅱ期、CIN Ⅲ期、SCC組中hTERC基因擴(kuò)增雜交信號≥3∶3型的異常細(xì)胞數(shù)占總異常細(xì)胞數(shù)的百分比分別為26.0%、52.1%、65.9%和90.7%，呈漸進(jìn)上升趨勢。見表6。

表6 宮頸異常病變患者h(yuǎn)TERC基因擴(kuò)增細(xì)胞雜交信號類型分布

圖1 宮頸異常病變患者h(yuǎn)TERC基因擴(kuò)增細(xì)胞雜交信號類型分布

3 討 論

FISH技術(shù)是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，其基本原理是利用堿基的互補(bǔ)性，將標(biāo)記上熒光素的探針與待測樣本的DNA進(jìn)行雜交，通過熒光顯微鏡收集熒光信號，從而對待測核酸進(jìn)行定性、定量及定位分析，可發(fā)現(xiàn)常規(guī)細(xì)胞遺傳技術(shù)無法檢測到的基因或染色體異常。FISH技術(shù)可直接檢測活檢實(shí)體腫瘤組織細(xì)胞中的基因改變，突破了檢測實(shí)體腫瘤基因異常受細(xì)胞培養(yǎng)困難的限制[4]，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷及血液腫瘤、實(shí)體瘤等方面的檢測。

FISH技術(shù)檢測宮頸脫落細(xì)胞TERC基因的擴(kuò)增主要包括以下幾個(gè)步驟：①樣本玻片制備程序；②樣本玻片預(yù)處理程序；③FISH雜交操作步驟；④雜交熒光信號的觀測。本實(shí)驗(yàn)從宮頸脫落細(xì)胞幾種取材和制片方法的角度，探討了雙色間期FISH技術(shù)用于宮頸脫落細(xì)胞TERC基因檢測的方法，成功得到了TERC基因在宮頸脫落細(xì)胞上的雜交熒光信號。從取材和制片方法對FISH結(jié)果影響來看，雜交是否成功與玻片制備的質(zhì)量、預(yù)處理過程關(guān)系密切。TCT低滲細(xì)胞制備過程中漂洗、離心等步驟去除了粘液等雜質(zhì)的干擾，血液污染少，經(jīng)過了低滲和膠原酶的處理使細(xì)胞質(zhì)易于消化，裸核細(xì)胞比例高，更易雜交，信號明顯，并且背景清晰，假陽性也隨之降低。新鮮的脫落細(xì)胞除了易于消化外，細(xì)胞染色質(zhì)破壞少也可能是導(dǎo)致雜交率高的原因。另外，新鮮涂片減少了TCT等保存液對染色體的破壞，也是致使雜交率高的原因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新鮮細(xì)胞直接涂片、生理鹽水制片、TCT低滲制片三種樣本玻片制備程序（樣本玻片預(yù)處理程序）中，以TCT低滲制片操作方法簡單快速，玻片背景最為清晰，雜交成功率最高。需要引起注意的是，以上3種制片方法都要求細(xì)胞涂片制作均勻，減少細(xì)胞重疊，玻片預(yù)處理時(shí)掌握合適的溫度和時(shí)間。本研究采用TCT低滲法制片進(jìn)行的初步臨床FISH檢測顯示炎癥患者FISH檢測的陽性率為4%（1/25）、CIN2患者FISH檢測的陽性率為72.7%（17/22）、宮頸癌患者FISH檢測的陽性率為100%（16/16），該結(jié)果與江靜等[5]所作的研究結(jié)果相似。

FISH技術(shù)已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷、各種腫瘤的檢測，用宮頸脫落細(xì)胞診斷宮頸癌的研究已有小樣本的相關(guān)報(bào)道[9-11]。 FISH技術(shù)檢測的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞中的DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被環(huán)境條件影響；其次操作相對簡單，穩(wěn)定性較好，可用于間期細(xì)胞，不需要細(xì)胞培養(yǎng)[12-14]；另外FISH結(jié)果的判定借助于對熒光的顏色判斷和信號計(jì)數(shù)，客觀上量化了檢測結(jié)果，最大限度的降低操作者和檢測著得主觀因素，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性[15,16]。我們采用原位雜交儀進(jìn)行探針的雜交代替了繁瑣的甲酰胺75℃水浴箱變性，—20℃梯度乙醇脫水，42℃孵化等步驟，避免了甲酰胺毒性物質(zhì)的接觸，試驗(yàn)顯示的結(jié)果清晰。

大量研究證明，HPV感染是宮頸癌的主要致病因素，甚至95%的癌前病變患者攜帶HPV癌基因，但只有很少病例最終發(fā)展到浸潤性宮頸癌，因此，HPV檢測特異性較低，篩查宮頸癌假陽性率高[2,17-19]。同樣TCT檢測中非典型增生和輕度細(xì)胞學(xué)異常在年輕婦女中很常見，低度病變發(fā)展比率也不高。故以上2種方法在臨床應(yīng)用上存在一定的局限性，所以研究人員試圖尋找更好的標(biāo)記來檢測早期宮頸癌。有研究發(fā)現(xiàn)，人類端粒酶RNA基因中，在長約450個(gè)堿基的人端粒酶RNA序列中，有一段長11個(gè)苷酸區(qū)域，發(fā)生在該模板區(qū)域的3號染色體長臂hTERC突變將導(dǎo)致端粒酶功能改變，從而出現(xiàn)染色體異常[20]。本試驗(yàn)采用FISH雙色探針成功檢測了hTERC基因擴(kuò)增，子宮頸瘤變組hTERC基因的紅色信號主要表現(xiàn)為3個(gè)或4～6個(gè)個(gè)而SCC中多出現(xiàn)10個(gè)TERC基因信號，在CINⅠ期以及SCC中的表達(dá)顯著概予健康女性正常宮頸組織，隨著CIN級別的增加、病變程度的升級，起陽性表達(dá)率與病變程度呈正相關(guān)。這說明端粒酶的異常激活可能發(fā)生在SCC的早期，隨病變進(jìn)展，端粒酶活性表達(dá)增高，提示端粒酶作為SCC的生物學(xué)標(biāo)志，用于宮頸癌篩查和早期診斷是可行的。

2003年和2005年Heselmeyer-Haddad等[8,21]分別對TCT剩余液體子宮頸細(xì)胞涂片和以往保存的子宮頸涂片，采用FISH探針成功地進(jìn)行hTERC基因檢測，他們的研究發(fā)現(xiàn)，CINⅠ期中hTERC基因擴(kuò)增者只占7.1%，而CIN Ⅱ期和CIN Ⅲ期占62.5%和76.4%，宮頸癌組中所有的細(xì)胞都出現(xiàn)了hTERC基因的擴(kuò)增。本試驗(yàn)結(jié)果顯示CINⅠ期中hTERC基因擴(kuò)增只占63.7%。而CIN Ⅱ期占89.4%，CIN Ⅲ期及SCC組中所有細(xì)胞都出現(xiàn)了hTERC基因擴(kuò)增。結(jié)果與Heselmeyer-Haddad等報(bào)道的趨勢一致，但所占比例和hTERC基因擴(kuò)增的異常細(xì)胞雜交信號類型有差別（圖1）。本研究中CINⅠ期/CIN Ⅱ期、CIN Ⅲ期/SCC3q拷貝異常明顯。且隨拷貝數(shù)比例增加出現(xiàn)2∶3、2∶4、2∶5、3∶3、5∶5以上的雜交類型，推測CIN可能與染色體的高度不穩(wěn)定性明顯相關(guān)，hTERC基因異?？截悢?shù)增加，可能是SC形成早期事件。由此可見，hTERC基因異常的染色體不穩(wěn)定性可能是SCC前病變發(fā)展到SC的重要因素之一。此外，58例CINⅠ期涂片中異常細(xì)胞雜交信號一2∶3和2∶5型為主，隨著CIN級別的升高3∶3、4∶4、5∶5等型號的信號比例上升，出現(xiàn)雙色大于3的多倍體在CIN Ⅲ期中雖hTERC基因擴(kuò)增率與SCC組的相同，但異常細(xì)胞占65.9%，低于SCC組涂片中的異常細(xì)胞（占90.7%）。故在臨床中，對于病檢hTERC出現(xiàn)陰性，但雜交信號2∶3和3∶3型以上的患者要予以嚴(yán)密隨訪，警惕SCC的發(fā)生。

本試驗(yàn)證明，用FISH 方法和特異的診斷探針檢測hTERC基因擴(kuò)增和染色體著絲粒的拷貝數(shù)，使染色體的非整體客觀上可見，起彌補(bǔ)了TCT細(xì)胞學(xué)和HPV病毒檢測指標(biāo)的不足。檢測hTERC基因可作為預(yù)測CINⅠ期/CIN Ⅱ期發(fā)展到CIN Ⅲ期/SCC的指標(biāo)，為早期發(fā)現(xiàn)SCC前病變提供了有價(jià)值的生物遺傳學(xué)監(jiān)測標(biāo)記。

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