何愛明，王乙林，林世明(.福建師范大學福清分校生物與化學工程系，福建福清350300;.福建省福清衛(wèi)生學校藥理教研組 ，福建 福清350300)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)又稱為非特異性潰瘍性結腸炎，是炎癥性腸病的一種，是臨床常見的一種消化道疾病，嚴重影響人類的健康，本病病變主要限于黏膜及黏膜下層，呈連續(xù)性非節(jié)段性分布，多累及直腸、乙狀結腸、左半結腸。臨床主要表現為腹痛、腹瀉、黏液樣血便、或有便秘、腹脹等消化道癥狀，常反復發(fā)作、纏綿難愈。其病因及發(fā)病機制尚未明確。近年來自由基在UC發(fā)病機制中的作用已成為研究的重要課題。研究提示，UC的發(fā)生、發(fā)展與氧自由基誘發(fā)的脂質過氧化有關［1］。

多年來，許多學者探索應用中醫(yī)藥治療UC，烏梅丸被廣泛運用于UC的臨床治療［2～4］，收到很肯定的療效，但均未究其作用機制。烏梅(Fructus Mume)是由薔薇科植物梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)的干燥近成熟果實加工而成。烏梅始載于《神農本草經》，列為中品?！吨袊幍?2010年版一部收載的“烏梅”正品有烏梅、烏梅肉和烏梅炭3種，其性味歸經皆為酸、澀，平。歸肝、脾、肺、大腸經。其功能主治為斂肺，澀腸，生津，安蛔。用于肺虛久咳，久痢滑腸，虛熱消渴，蛔厥嘔吐腹痛;膽道蛔蟲癥。

本文通過測定過氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醇(MDA)含量水平的變化，進行探討烏梅對化學試劑誘導的小鼠UC的作用及作用機制，以期為今后進一步研究提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥品 SOD、MDA試劑盒購于南京建成生物工程公司。其余試劑均為分析純。

烏梅購于宜又佳連鎖藥店，由云南白藥集團天紫紅藥業(yè)有限公司昆明中藥飲片廠生產，取烏梅(去核)加6倍量水，加熱煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾渣再加同樣量水，加熱煮沸30 min，雙層紗布過濾，合并濾液于水浴加熱濃縮至所需濃度備用［5］?！吨袊幍洹?005年版一部規(guī)定人用劑量為6～12 g/d，因藥材水煮濃縮后制備出來的供試液極其黏稠，故高劑量組的給藥濃度設定為0.4 g/ml、10 ml/kg。小鼠低、中、高劑量按成人最大劑量的 5、10、15 倍給藥，即 2、4、6 g 生藥/(kg·d)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)為上海前塵生物科技有限公司產品。

1.2 儀器 恒溫水浴箱為江蘇省太倉醫(yī)療器械廠產品，低溫離心機為珠海黑馬醫(yī)學儀器公司產品。

1.3 動物 健康昆明種小鼠，SPF級，雄性，體重為(20±2)g，90只。由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號:閩實動質準第00205號。

2 方法

2.1 造模方法 動物適應性飼養(yǎng)1周后，按體重大小隨機分為正常組、模型組、烏梅低、中、高劑量組5組，每組15只。動物禁食不禁水24 h，留取正常組15只動物，其余60只小鼠再參照文獻報道［6］，用 3%DSS(分子量 500 000)溶液給小鼠自由飲水，連續(xù)7 d。造模期間每天觀察小鼠性狀、飲食、毛發(fā)、活潑狀態(tài)等。模型建立成功的標志為飲用3%DSS后出現稀便、腹瀉、大便隱血(+)或肉眼血便的任一癥狀。選取造模成功的小鼠隨機分入各組。

2.2 給藥與標本處理方法 造模成功后，即造模第8天開始灌胃，正常組、模型組分別給予0.33 ml生理鹽水灌胃，烏梅低、中、高劑量組分別按設計劑量給藥。每天一次，均連續(xù)給藥10 d，期間除正常組小鼠自由飲用生理鹽水，其他各組小鼠自由飲用3%DSS水溶液，并且每天定時稱量小鼠體重，進行隱血試驗和觀察糞便性狀。分別在試驗第5天、第10天，將小鼠稱重，并放入代謝籠中，收集小鼠大便，記錄大便性狀，且取部分糞便測定隱血。進行疾病活動度(DAI)評分，評分標準見表1。DAI=體重下降分數+大便性狀分數+隱血分數。

表1 疾病活動度評分

2.3 組織形態(tài)學評分標準與方法 給藥結束后脫頸處死小鼠，剪開腹腔，取全段結腸，剪開，生理鹽水洗干凈，平鋪于白板上置于放大鏡下肉眼觀察結腸大體形態(tài)、結腸黏膜損傷情況;將固定的結腸組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察結腸組織形態(tài)學變化。按評分標準［7］進行組織形態(tài)學評分。

2.4 SOD、MDA的測定 取炎癥改變最明顯處的結腸粘膜組織，濕重200 mg，用4℃冰生理鹽水洗凈，除去血污，濾紙吸干，稱重用勻漿器在冰浴條件下制成勻漿，低溫離心機4 000 r/min離心15 min，取適量上清液分裝于EP管，-20℃保存，按試劑盒說明操作檢測SOD活力及MDA含量。

2.5 統(tǒng)計學分析 實驗數據應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料采用(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，經方差齊性檢驗后，方差齊時用 Scheffe法，方差不齊時用Games-Howell法。

3 結果

3.1 小鼠一般情況的影響 試驗后第5～6天，造模小鼠出現腹瀉、飲食減少、體毛無光澤、第6～7天出現不同程度的肉眼血便，蜷縮，活動減少，體重減輕。經供試品治療7 d后，烏梅中、高劑量組無肉眼血便，可見松散大便。正常對照組小鼠一般性狀無明顯改變。

3.2 小鼠的疾病活動度評分 試驗結果顯示，烏梅低、中、高劑量組的DAI均降低，其中低劑量組與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與正常組比較無顯著性差異。評分結果見表2。

表2 各組小鼠的疾病活動度評分(±s)

表2 各組小鼠的疾病活動度評分(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，與模型組比較;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數量 劑量［g/(kg·d)］評分正常組15 0 0模型組 15 0 10.16±0.36低劑量組 15 2 7.86±0.211)4)中劑量組 15 4 3.35±0.242)3)高劑量組 15 6 2.16±0.172)

3.3 小鼠結腸黏膜損傷與評分 肉眼及光鏡下觀察模型組黏膜糜爛重，潰瘍多而且大，黏膜嚴重充血、水腫;烏梅高劑量組黏膜糜爛不嚴重，潰瘍小，黏膜充血、水腫程度輕;烏梅低劑量組黏膜糜爛較嚴重，潰瘍仍較明顯，黏膜充血、水腫程度亦可見及，無明顯減輕;烏梅中劑量組的組織損傷介于高劑量組和低劑量組之間。正常組動物未見及黏膜充血、水腫和糜爛，黏膜光滑平整。評分結果見表3。

表3 肉眼及光鏡下觀察各組小鼠結腸黏膜損傷與評分的比較(±s)

表3 肉眼及光鏡下觀察各組小鼠結腸黏膜損傷與評分的比較(±s)

1)P ﹤0.05，2)P ﹤0.01，與模型組比較;3)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數量 劑量 肉眼評分 光鏡下評分［g/(kg·d)］正常組15 0 0 0模型組 15 0 7.98±0.29 4.23±0.24低劑量組 15 2 5.98±0.231)3) 4.13±0.263)中劑量組 15 4 4.51±0.232)3) 2.19±0.211)3)高劑量組 15 6 1.16±0.242) 1.18±0.122)

3.4 小鼠結腸組織SOD活力與MAD含量 試驗結果顯示，烏梅低、中、高劑量組的SOD活力值雖均低于正常組，但均高于模型組，其中低劑量組與模型組比較無顯著性差異，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與正常組比較無顯著性差異，結果見表4。測得MDA含量中，烏梅低、中、高劑量組雖均高于正常組但均低于模型組，其中低劑量組與模型組比較無顯著性差異，中、高劑量組與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與正常組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，中、高劑量組與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，結果見表4。

表4 各組小鼠結腸組織SOD活力與MAD含量的改變(±s)

表4 各組小鼠結腸組織SOD活力與MAD含量的改變(±s)

1)P ﹤0.01，模型組比較;2)P ﹤0.05，3)P ＜0.01，與正常組比較。

組別 數量 劑量SOD(U/g) MDA(nmol/g)［g/(kg·d)］正常組15 0 22.65±2.21 8.42±1.52模型組 15 0 11.03±1.95 36.75±2.02低劑量組 15 2 12.25±1.583) 31.16±2.612)中劑量組 15 4 18.28±1.591)2)15.84±1.631)2)高劑量組 15 6 19.32±1.881) 16.25±1.481)2)

4 討論

DSS誘導的UC是一個重要模型，DSS破壞腸黏膜屏障，使粘膜組織凝固壞死，增加DSS的通透性，促進DSS在結腸中擴散，加重炎癥反應［8］。該模型具有操作簡單、重現性好、造型時間短等特點。因此比較適合該類藥物的研究與篩選。潰瘍性結腸炎(UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，IBD已被公認為是胃腸道中除惡變外最嚴重的疾病之一，流行病學實驗表明，結腸癌的發(fā)生、發(fā)展與結腸炎癥的反復發(fā)作密切相關，目前UC的病因與發(fā)病機制并不十分清楚。

近年來研究發(fā)現，炎癥介質(白三烯、前列腺素等)在UC炎癥反應中作用倍受重視，氧自由基(OFR)參與并且通過脂質過氧化反應產生這些物質。OFR在UC的發(fā)病中起重要作用，細胞中的脂類物質受到OFR作用時，發(fā)生脂質過氧化反應，產生一些分解產物，如MDA等。MDA為脂質過氧化的終末產物，其含量反映了組織中過氧化損傷程度。SOD是重要的過氧化物歧化酶，能有效地清除氧自由基，從而抑制腸組織中的脂質過氧化反應，并能穩(wěn)定細胞膜。SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MAD的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究中，模型組小鼠的DAI評分和大體形態(tài)以及組織學評分均明顯高于正常組，模型組小鼠結腸中SOD活性顯著低于正常組。模型組小鼠結腸中MDA含量顯著高于正常組，這些反映了氧化應激過程。尤其是氧自由基誘發(fā)的脂質過氧化與潰瘍性結腸炎有關［9］，可能是其發(fā)病機制之一。

本實驗結果表明，自由基與UC的結腸組織損傷密切相關，參考UC的病理過程，用烏梅治療后UC組織中的MDA含量降低，SOD活性提高，疾病活動度降低，組織病理改變明顯減輕，說明UC發(fā)病的自由基學說為減少MDA含量以及抗氧化治療提供了理論依據，降低自由基水平可以為治療潰瘍性結腸炎提供新的途徑。

［1］丁偉群，林庚金.潰瘍性結腸炎發(fā)病中白介素水平的變化［J］.復旦學報，2001，13(4):61.

［2］吳邱保.加味烏梅丸與柳氮磺毗啶治療慢性潰瘍性結腸炎的療效比較［J］.廣東醫(yī)學院學報，2006，24(5):487.

［3］郭洪波，羅玉梅，王靜波.烏梅湯加減治療潰瘍性結腸炎44例［J］.新中醫(yī)，2007，39(1):44.

［4］董少群，李耀清.烏梅丸加減治療慢性非特異性潰瘍性結腸炎64 例［J］.河南醫(yī)藥信息，2002，10(17):45.

［5］王 璐，張紅宇，王 莉.烏梅及其炮制品大鼠長期毒性研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(10):67.

［6］易先國，李 衛(wèi)，吳海港，等.香連滴丸對潰瘍性結腸炎模型小鼠療效試驗［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46(11):28.

［7］張 濤，施 斌，陳建永，等.潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜CINC-1及其受體CXCR2的表達及意義［J］.世界華人消化雜志，2009，17(1):78.

［8］劉 穎，王 瑩.甘草酸二銨抗大鼠潰瘍性結腸炎作用及抗炎機制研究［J］.中國新藥雜志，2007，16(14):2027.

［9］劉詩權，于皆平，冉宗學.銀杏葉萃取物抗肝纖維化作用的實驗研究［J］.中華臨床醫(yī)藥，2002，3(11):1.