溫悅萌 張?zhí)鞖W 謝嵐 艾華 管又飛

1北京大學(xué)第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所營養(yǎng)生化研究室（北京100191）

2北京大學(xué)肥胖與代謝病研究中心 3北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細胞內(nèi)一種重要的亞細胞器，主要參與蛋白質(zhì)的初步合成、修飾與加工。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指由于各種原因?qū)е碌募毎麅?nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂、蛋白質(zhì)合成過程受到影響的一種生理病理過程[1，2]。有研究報道，急性運動可提高組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達[3-5]，但急性運動引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因尚不清楚[6]。急性運動可導(dǎo)致糖原大量消耗，糖原儲備量和消耗量對急性運動引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有何影響不明確。本實驗通過力竭游泳運動探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其機制問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

雄性C57BL/6小鼠16只，體重24.0～26.0 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。小鼠在SPF級環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，溫度（22±1）℃，濕度 40%～60%，12 h明暗循環(huán)。小鼠自由攝食和飲水，均喂食普通飼料，由北京科澳協(xié)力公司提供。

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。小鼠隨機分為安靜組（8只）和運動組（8只）。運動組小鼠采用一次性力竭游泳運動，無負重，水溫（30±2）℃，水深 50 cm。判斷力竭的標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠沉入水中5 s不能自主浮上水面，且呼吸急促，對刺激反應(yīng)遲緩，無逃避反應(yīng)。安靜組小鼠不運動。

1.2 標(biāo)本采集和保存

力竭游泳后4 h，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，腹主動脈取血，迅速轉(zhuǎn)入EDTA抗凝的離心管中，混勻后室溫離心（3000 r/min，20 min）分離血漿，分裝后液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。迅速取出肝臟和股四頭肌組織，PBS沖洗干凈，用鋁箔紙包好，投入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。速取肝左葉組織，投入4%福爾馬林固定液中固定4～8小時，后常規(guī)石蠟包埋。安靜組小鼠標(biāo)本采集時間和方法同運動組。

1.3 測試指標(biāo)和方法

分別取肝臟和股四頭肌組織100 mg加入1 ml RIPA裂解液，制備組織勻漿液。采用western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白表達，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、肌醇需酶 1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）、磷酸化肌醇需酶1（p-IRE1）一抗由Abcam公司提供；雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類激酶 （double-stranded RNA-dependent protein kinase （PKR）-like ER kinase，PERK）和磷酸化 PERK（p-PERK）一抗由 Santa Cruz公司提供；內(nèi)參蛋白質(zhì)3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗由Bioworld公司提供。熒光二抗由中杉金橋公司提供。利用Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)采集圖像并進行灰度分析。

分別取肝臟和股四頭肌組織50 mg加入1 ml Trizol提取RNA，Trizol試劑購自Invitrogen公司。采用實時定量RT-PCR方法檢測GRP78、剪切型的X盒結(jié)合蛋白 1（X box binding protein 1 splicing，XBP1s）、C/EBP 同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP）、生長停滯和誘導(dǎo) DNA損傷基因 34（growth arrest and DNA damage-inducible gene 34，GADD34）的 mRNA 表達水平，β-肌動蛋白（β-actin）mRNA作為內(nèi)參。cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光染料 SuperReal PreMix（SYBR Green） 購自 TIAN GEN BIOTECH公司。各引物序列見表1。

實時定量RT-PCR測試主要過程:預(yù)變性95℃30 s，PCR 反應(yīng) 95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。檢測CT值。

采用日立7170A全自動分析儀以葡萄糖氧化酶法測定血糖。采用已糖激酶法測定肝糖原和肌糖原，分別取肝臟組織75 mg和股四頭肌組織85 mg，按1:3加入堿液，沸水浴煮20 min制備糖原檢測液。空白管調(diào)零，在620 nm波長處測定OD值。試劑盒購自KeyGEN公司。

表1 實時定量RT-PCR方法測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激各標(biāo)志蛋白質(zhì)mRNA引物序列

肝臟和骨骼肌組織由Leica石蠟切片機切片，HE染色，用Nikon E600顯微鏡圖像采集系統(tǒng)照相并觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析使用SPSS 18.0軟件完成。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。安靜組和運動組均值比較采用獨立樣本t檢驗。資料服從雙變量正態(tài)分布時，選擇Pearson方法對運動組進行相關(guān)分析，不服從時，選擇Spearman方法。P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達水平

與安靜組相比，運動組小鼠肝臟組織GRP78、p-PERK/PERK和p-IRE1/IRE1表達分別增加了49.39%、16.54%和21.11%，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）（圖 1A）； 股四頭肌組織 GRP78、p-PERK/PERK和p-IRE1/IRE1表達分別增加了22.33%、15.26%和22.05%，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）（圖 1B）。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白mRNA表達水平

運 動 組 肝 臟 組 織 GRP78、XBP1s、CHOP 和GADD34 mRNA表達分別是安靜組的1.93倍、1.84倍、1.76倍和2.04倍，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.001）（圖 2A）； 運動組股四頭肌組織 GRP78、XBP1s、CHOP和GADD34 mRNA表達分別是安靜組的1.53倍、2.21倍、1.68倍和1.8倍，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）（圖 2B）。

2.3 血糖和糖原水平

表2顯示，與安靜組相比，運動組一次性力竭游泳運動后4小時血糖水平下降16.78%，有顯著性差異（P<0.05），肝糖原水平下降了14.24%，有極顯著性差異（P<0.01），肌糖原水平減少了53.85%，有極顯著性差異（P<0.001）。

表2 安靜組和運動組血糖和糖原水平比較

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達與血糖和糖原含量的相關(guān)分析

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白及mRNA表達量均與血糖及糖原含量呈顯著負相關(guān)（r值和P值見表3）。

2.5 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，安靜組（圖3A）肝組織細胞結(jié)構(gòu)完整；運動組（圖3B）部分肝細胞輪廓改變，胞漿疏松水腫（如箭頭所指）。運動組骨骼肌形態(tài)學(xué)與安靜組未見明顯差異（結(jié)果未給出）。

3 討論

真核細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時的主要表現(xiàn)是未折疊或者錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積，引發(fā)所謂的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng) （unfolded protein response，UPR）[7]。GRP78 可與未折疊和錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，其表達增多是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要標(biāo)志[8]。迄今研究發(fā)現(xiàn)，URP主要通過PERK、IRE1以及活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）3種跨膜蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生。在生理狀態(tài)下，這3種跨膜蛋白均與伴侶蛋白GRP78結(jié)合呈無活性狀態(tài)[9]，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，GRP78與3種跨膜蛋白脫離，轉(zhuǎn)去結(jié)合未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，從而磷酸化激活這3種跨膜蛋白，進而激活其下游的CHOP和XBP1s，分別通過抑制新蛋白質(zhì)的翻譯與合成、增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的正確折疊能力和激活其下游基因的轉(zhuǎn)錄[1，10]等方式加快蛋白質(zhì)的正確折疊，達到防止未折疊、錯誤折疊蛋白質(zhì)大量聚集的目的[11]。故本次實驗選用GRP78和磷酸化/非磷酸化的PERK、IRE1作為標(biāo)志蛋白，用于檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于劇烈或持久時，細胞自身不能有效地清除未折疊的蛋白質(zhì)，就會啟動相關(guān)的凋亡程序[12，13]，這也是應(yīng)激細胞發(fā)生損傷的重要原因。 故本實驗選取了CHOP和GADD34這兩個既反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激又反映細胞凋亡的指標(biāo)。

表3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白及m RNA表達量與血糖及糖原含量相關(guān)分析

圖3 安靜組（A）和運動組（B）兩組肝臟組織結(jié)構(gòu)（×400）

本次實驗觀察到，一次性力竭運動后，肝臟和股四頭肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、p-PERK/PERK和p-IRE1/IRE1表達較安靜組均顯著升高，其中肝臟組織應(yīng)激程度較大。同時，其下游分子CHOP、XBP1s和GADD34 mRNA表達也顯著升高，與標(biāo)志蛋白表達結(jié)果一致。 這與 Gonzalez 等[14]、Stary 等[15]和Wu等[3]通過一次性跑臺運動發(fā)現(xiàn)肝臟和骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子表達顯著升高一致。

糖原是機體儲存能量的重要方式，以骨骼肌和肝臟儲量最為豐富，與機體運動能力密切相關(guān)，而一次性力竭運動可導(dǎo)致糖原儲備大量消耗。本實驗結(jié)果顯示，盡管力竭性游泳已過去4小時（4小時是為觀察標(biāo)志蛋白質(zhì)表達所預(yù)留的時間），糖原含量已部分恢復(fù)，但仍顯著低于對照組，血糖、肝糖原和肌糖原分別降低16.78%、14.24%和53.85%。我們推測，糖原儲備量和消耗量可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度有關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，血糖水平和糖原含量均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達呈顯著負相關(guān)，即糖原含量越低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達越高。本實驗中，急性力竭運動導(dǎo)致肌糖原的大量消耗，隨著運動時間延長，為了滿足肌肉收縮的能量需要，骨骼肌從細胞外攝取葡萄糖增加，導(dǎo)致血糖水平下降；為了維持血糖穩(wěn)定，肝臟糖異生和糖原分解作用加強，從而使肝糖原下降[16，17]。 我們的研究中，相關(guān)分析結(jié)果顯示，血糖水平越低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達越高。這提示糖原儲備量和消耗量可能是一次性急性力竭運動引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)聯(lián)因素。糖原消耗導(dǎo)致局部和全身組織中的快捷供能物質(zhì)下降，引起能量供應(yīng)不足，最后導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。糖原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用還有待深入研究。

我們還發(fā)現(xiàn)，一次性急性力竭運動可導(dǎo)致部分肝臟細胞胞漿水腫，這可能是暫時性的。尚未發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞有此變化。有人推測，細胞胞漿水腫可能與肝細胞三磷酸腺苷（ATP）減少、能量供應(yīng)不足有關(guān)[18，19]。 急性力竭運動導(dǎo)致肝糖原大量消耗，是肝細胞ATP減少的重要原因。肝細胞水腫可導(dǎo)致肝細胞結(jié)構(gòu)的暫時變化，而這種暫時性的結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，值得進一步探討。

生活中，常見一些不常參加運動鍛煉者突然進行一次大運動量、疲勞性運動，如馬拉松跑、登山、遠足、游泳等。這種急性運動往往導(dǎo)致深度疲勞，肌肉酸痛，數(shù)天難以恢復(fù)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對機體的影響實質(zhì)上是對蛋白質(zhì)合成代謝的影響，而運動后蛋白質(zhì)的合成對運動性修復(fù)極為關(guān)鍵。急性運動引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而影響蛋白質(zhì)的合成和運動后修復(fù)，這可能是疲勞難以恢復(fù)的原因之一。如果平時多吃碳水化合物含量較多的食物，提高體內(nèi)糖原含量，并經(jīng)常多做鍛煉，改善糖原利用狀態(tài)，有可能減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度，加快疲勞恢復(fù)。相關(guān)的機制和猜測，還需研究加以證實。

4 小結(jié)

一次性力竭運動可引起肝臟和股四頭肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激明顯增加。肝糖原和肌糖原的儲備和運動消耗量可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度有關(guān)。

[1]Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease.Cell，2010，140（6）:900-917.

[2]溫悅萌，艾華.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥、肥胖、脂代謝和運動關(guān)系研究進展.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2011（9）:870-873.

[3]Wu J，Ruas JL，Estall JL，et al.The unfolded protein response mediates adaptation to exercise in skeletal muscle through a PGC-1alpha/ATF6alpha complex.Cell Metab，2011，13（2）:160-169.

[4]Staib JL，Tumer N，Powers SK.Increased temperature and protein oxidation lead to HSP72 mRNA and protein accumulation in the in vivo exercised rat heart.Exp Physiol，2009，94（1）:71-80.

[5]Noble EG，Ho R，Dzialoszynski T.Exercise is the primary factor associated with Hsp70 induction in muscle of treadmill running rats.Acta Physiol（Oxf），2006，187（4）:495-501.

[6]Morton JP，Kayani AC，McArdle A，et al.The exercise-induced stress response of skeletal muscle，with specific emphasis on humans.Sports Med，2009，39（8）:643-662.

[7]Ron D，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（7）:519-529.

[8]Rasheva VI，Domingos PM.Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis.Apoptosis，2009，14（8）:996-1007.

[9]Oslowski CM，Urano F.Measuring ER Stress and the Unfolded Protein Response Using Mammalian Tissue Culture System.Methods Enzymol，2011，490:71-92.

[10]Zhang K，Kaufman RJ.From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response.Nature，2008，454 （7203）:455-462.

[11]Morton JP，Kayani AC，McArdle A，et al.The exercise-induced stress response of skeletal muscle，with specific emphasis on humans.Sports Med，2009，39（8）:643-662.

[12]Fribley A，Zhang K，Kaufman RJ.Regulation of apoptosis by the unfolded protein response.Methods Mol Biol，2009，559:191-204.

[13]Zhang K，Kaufman RJ.Identification and characterization of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in vivo.Methods Enzymol，2008，442:395-419.

[14]Gonzalez B，Manso R.Induction，modification and accumulation of HSP70s in the rat liver after acute exercise:early and late responses.J Physiol，2004，556（Pt 2）:369-385.

[15]Stary CM，Walsh BJ，Knapp AE，et al.Elevation in heat shock protein 72 mRNA following contractions in isolated single skeletal muscle fibers.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295（2）:R642-R648.

[16]Foskett A，Williams C，Boobis L，et al.Carbohydrate availability and muscle energy metabolism during intermittent running.Med Sci Sports Exerc，2008，40（1）:96-103.

[17]Lima-Silva AE，De-Oliveira FR，Nakamura FY，et al.Effect of carbohydrate availability on time to exhaustion in exercise performed at two different intensities.Braz J Med Biol Res，2009，42（5）:404-412.

[18]Febbraio MA，Steensberg A，Walsh R，et al.Reduced glycogen availability is associated with an elevation in HSP72 in contracting human skeletal muscle.J Physiol，2002，538（Pt 3）:911-917.

[19]Howarth KR，Phillips SM，MacDonald MJ，et al.Effect of glycogen availability on human skeletal muscle protein turnover during exercise and recovery.J Appl Physiol，2010，109（2）:431-438.