付維力 王踐云 李箭 萬昌秀 葉京兵 羅大輝 李棋

1 四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科（成都 610041） 2 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院

近年來，利用組織工程原理和技術(shù)重建嚴(yán)重?fù)p傷的半月板或治療半月板缺失的患者，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-6]。目前，應(yīng)用于組織工程半月板的支架材料還處于廣泛的篩選和試驗(yàn)階段，而單一的無機(jī)材料和單一的有機(jī)材料均難以滿足臨床對組織工程半月板的生物活性及生物力學(xué)性能的綜合要求。如何結(jié)合天然和合成、有機(jī)和無機(jī)支架材料的各自優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建符合組織工程半月板要求的復(fù)合材料，是目前支架材料的研究熱點(diǎn)[7]。殼聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的生物降解性能，其結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中蛋白多糖分子鏈的結(jié)構(gòu)單元糖胺聚糖相似。它屬于pH依賴性陽離子聚合物，可與陰離子反應(yīng)生成聚電解質(zhì)配合物而具多重生物活性，其單體上的氨基基團(tuán)可作為活性基團(tuán)與醛基反應(yīng)。但其缺點(diǎn)是力學(xué)強(qiáng)度不夠。而聚磷酸鈣（calcium polyphosphate，CPP）具有良好的生物相容性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，并具備優(yōu)良的力學(xué)性能。殼聚糖與聚磷酸鈣兩者復(fù)合可以取長補(bǔ)短，提高其力學(xué)強(qiáng)度和生物相容性。因傳統(tǒng)交聯(lián)劑如戊二醛、乙二胺等隨著材料降解逐漸出現(xiàn)毒副作用，本實(shí)驗(yàn)針對復(fù)合支架材料的降解和交聯(lián)劑的選擇等問題，探索了一種天然材料海藻酸鈉來源研制的新型生物交聯(lián)劑醛基化海藻酸鈉（aldehyde alginate，ADA）[8，9]，在此基礎(chǔ)上，采用化學(xué)交聯(lián)固化法將CS、ADA和CPP有機(jī)地結(jié)合起來，制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料；通過觀察半月板細(xì)胞在不同配比CS/CPP支架材料上的生長、增殖狀況，為支架材料探索最佳的CS/CPP比例，為組織工程半月板支架材料的優(yōu)選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級健康1周齡新西蘭乳兔，雌雄不限，約200～300 g，由四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1:1 DMEM/F12（DF）、FBS、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本）；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），掃描電鏡（JSM-6700F，JEOL，日本）；鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體、鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體（Oncogene公司，美國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；碳酸鈣、磷酸、高碘酸鈉（分析純，成都科龍化工試劑廠）；海藻酸鈉（分析純，浙江晶巖生物有限公司）；殼聚糖（醫(yī)用級，浙江澳興生物有限公司）。

1.2 半月板纖維軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

無菌條件下取1周齡新西蘭乳兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板，放入盛有DF培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含1%慶大霉素的PBS沖洗3遍，剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊，然后用0.25%胰蛋白酶37℃預(yù)消化30 min，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶37℃恒溫水浴搖床振蕩消化4～6 h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后，用巴氏吸管吹打2 min，終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，1.2k r/min離心5 min，棄上清，PBS洗兩次，細(xì)胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS的DF培養(yǎng)基的底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。待細(xì)胞鋪滿瓶底（80%～90%融合）后，用含0.1%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。通過細(xì)胞化學(xué)（HE染色、甲苯胺藍(lán)、番紅O）、Ⅰ型和Ⅱ型膠原免疫組化對體外培養(yǎng)的半月板細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 殼聚糖/聚磷酸鈣復(fù)合支架材料的制備

稱取質(zhì)量比例分別為10:0、7:3、5:5、3:7的CS、CPP，分別溶入醋酸溶液和無水乙醇，共混加熱攪拌制備成均一的CS/CPP混合物，加入ADA溶液交聯(lián)，高速攪拌2 min。迅速將制備的CPP/CS/ADA凝膠轉(zhuǎn)入到模具中，將填有凝膠混合物的模具轉(zhuǎn)入冰箱中，于-20℃冷凍4 h，使固液相分離。之后使用冷凍干燥機(jī)于壓力為0.5 mmHg、-5℃條件下干燥24 h，以完全除去溶劑。干燥完畢后，即得到不同CS/CPP比例的復(fù)合多孔支架。取制備的不同配比CS/CPP三維多孔支架，樣品表面噴鉑金處理后，于掃描電鏡下觀察樣品的結(jié)構(gòu)形貌，通過排液法測定支架的孔隙率。取三維多孔支架（直徑5 mm，高3 mm）分別加入6孔板內(nèi)，封口后經(jīng)Co-60 射線（照射總劑量為25KGy）消毒后備用。

1.4 組織工程化半月板的體外復(fù)合培養(yǎng)

取單層培養(yǎng)條件下生長良好的第三代半月板纖維軟骨細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA按1:1混合酶消化，收集細(xì)胞，制備2×107/ml密度的細(xì)胞懸液。用10 μl的微量移液槍將細(xì)胞懸液以10 μl/材料樣品緩慢均勻滴加于材料上，然后放于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使細(xì)胞粘附到材料中。再將剩下的細(xì)胞滴加到材料上，并于材料底部滴加10μl培養(yǎng)基保濕，置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使接種的半月板細(xì)胞第二次沉淀到支架上，緩慢從材料旁邊加入含10%FBS的DF培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。隔日換液，體外復(fù)合培養(yǎng)7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

形態(tài)學(xué)觀察:復(fù)合后，隔日于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞在支架材料上的生長和粘附情況。

組織學(xué)染色觀察:復(fù)合培養(yǎng)7 d后，各取一塊不同配比的材料于4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，行HE組織化學(xué)染色，光鏡下觀察。

掃描電鏡觀察:復(fù)合培養(yǎng)7 d后取出標(biāo)本，分別取一塊不同配比的材料PBS漂洗，2.5%戊二醛固定2 h，PBS沖洗，梯度乙醇上行脫水，醋酸異戊酯保存，CO2干燥器干燥、噴金、黏托，掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 半月板纖維軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)觀察（圖1）

半月板纖維軟骨細(xì)胞原代接種后8 h有少量細(xì)胞開始貼壁，48～72 h多數(shù)細(xì)胞貼壁完全，胞質(zhì)逐漸展開，細(xì)胞變大伸長，形成突起，呈多角形，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，鏡下觀察有立體感，出現(xiàn)明顯的集落樣分區(qū)，表現(xiàn)“細(xì)胞群聚”現(xiàn)象，7～9 d后，細(xì)胞長滿傳代。傳代后細(xì)胞貼壁生長能力和增殖速度明顯加快。第2代后細(xì)胞形態(tài)開始逐漸變?yōu)樗笮?，?代后細(xì)胞生長速度減慢，增殖減緩。細(xì)胞HE染色、甲苯胺藍(lán)、番紅O和免疫組化染色顯示:體外分離培養(yǎng)的第3代半月板細(xì)胞Ⅰ型和Ⅱ型膠原均表達(dá)陽性，并分泌蛋白聚糖，其基本維持半月板纖維軟骨細(xì)胞的表型。

2.2 支架材料的檢測

掃描電鏡下觀察可見:孔徑大小和分布較均勻，并且相互貫通，孔徑分布在200～500 μm之間（圖2）。通過排液法測定支架的孔隙率在75%～86%之間。使用ADA交聯(lián)制備出的復(fù)合支架生物材料具有較高的孔隙率和孔徑。

2.3 半月板纖維軟骨細(xì)胞與殼聚糖/聚磷酸鈣體外復(fù)合培養(yǎng)觀察

2.3.1 倒置相差顯微鏡觀察

半月板纖維軟骨細(xì)胞接種后呈球形，黏附于多孔支架邊緣，培養(yǎng)液中可見少量懸浮細(xì)胞，1 h后細(xì)胞開始貼壁，4 h后大部分細(xì)胞貼壁完全，呈短梭形或多角形，形態(tài)規(guī)則；3～5 d后可見細(xì)胞在支架上黏附良好，支架孔隙逐漸被細(xì)胞以及分泌的基質(zhì)填滿，細(xì)胞支架復(fù)合體輪廓逐漸明顯。

2.3.2 HE染色

HE染色（圖3）可見:半月板軟骨細(xì)胞粘附于支架材料上，呈梭形或多角形，胞漿紅染，細(xì)胞核呈圓形或者卵圓形。可見核仁和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞可見分裂相?？锥磧?nèi)可見細(xì)胞生長，并有基質(zhì)分泌。

2.3.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察（圖4）可見，復(fù)合培養(yǎng)7 d，細(xì)胞在支架上均勻分布，緊貼支架上生長，細(xì)胞多數(shù)呈多角形，形態(tài)規(guī)則，大小均一，立體感強(qiáng)，可見大量基質(zhì)分泌。其中3:7的CS/CPP支架材料上，半月板細(xì)胞生長良好，數(shù)目最多，接近覆蓋整個(gè)支架表面，生長極其旺盛，連接緊密，融合成片，細(xì)胞外基質(zhì)分泌也最多。

3 討論

3.1 半月板纖維軟骨細(xì)胞的鑒定

圖1 MFCs形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和免疫組化染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）

圖2 掃描電鏡觀察不同比例CS/CPP復(fù)合三維多孔支架（×1200）

圖3 MFCs與不同比例CS/CPP復(fù)合培養(yǎng)7d組織學(xué)觀察（HE×200）

圖4 MFCs與不同比例CS/CPP復(fù)合培養(yǎng)7d掃描電鏡觀察（×1200）

對于將半月板細(xì)胞歸類于軟骨細(xì)胞還是成纖維細(xì)胞，一直存在爭議。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，半月板組織包含成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和軟骨細(xì)胞兩種細(xì)胞亞型，因此認(rèn)為將其稱為纖維軟骨細(xì)胞較合適。形態(tài)學(xué)上，半月板細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下顯示三種不同的細(xì)胞類型:伸長的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、多邊形細(xì)胞和小圓的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞[10]。半月板組織ECM中膠原成分主要為I型膠原（占90%以上），此外，還含有II、III、V型等膠原成分[11]。有學(xué)者根據(jù)半月板細(xì)胞形態(tài)、分布和ECM的不同，把半月板細(xì)胞分為不同的細(xì)胞亞群:纖維軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和位于淺表層區(qū)的細(xì)胞。纖維軟骨細(xì)胞位于半月板內(nèi)側(cè)2/3和深部，呈圓形或橢圓形，有活躍的分泌功能，ECM成分主要為Ⅰ、Ⅱ型膠原，其比例為2:3，提供半月板的支架結(jié)構(gòu)和抗拉伸性能，還包括提供抗壓縮性能的蛋白多糖；成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞位于外周1/3，該區(qū)域含少量ECM，主要為Ⅰ型膠原[12]。再者，由于成年兔半月板組織細(xì)胞成分較少，我們采用1周齡新西蘭乳兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。II型膠原含量可能也與半月板組織的發(fā)育有關(guān)。綜上，本研究通過Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)鑒定第三代細(xì)胞仍具備半月板纖維軟骨細(xì)胞的表型。

3.2 半月板細(xì)胞與支架材料的復(fù)合培養(yǎng)

半月板細(xì)胞與支架材料的復(fù)合是體外構(gòu)建組織工程半月板的關(guān)鍵技術(shù)，主要通過細(xì)胞和支架材料的雙向選擇評價(jià)其用于半月板組織工程的可行性。主要影響因素有:支架材料的組成、孔隙率、孔徑、厚度，細(xì)胞的種類和代數(shù)，植入方式、接種密度、時(shí)間，復(fù)合體所處的微環(huán)境等。Neves等[13]研究得出，細(xì)胞－支架復(fù)合物體外培養(yǎng)7天時(shí)能獲得最高的細(xì)胞密度。7天后細(xì)胞增殖到平臺期時(shí)，ECM的合成速率顯著下降。故建議構(gòu)建組織工程半月板時(shí)，細(xì)胞/支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)不應(yīng)超過7天。Iwasa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建軟骨組織工程接種的細(xì)胞密度應(yīng)不少于2×107/ml。本實(shí)驗(yàn)采用二次沉淀接種法將第三代半月板纖維軟骨細(xì)胞以2×107/ml種植于不同配比CS/CPP支架上，體外培養(yǎng)7天，該方法可以增加種子細(xì)胞沉積粘附的數(shù)量和ECM的分泌。

3.3 生物材料的生物學(xué)界面反應(yīng)

生物材料是構(gòu)建組織工程半月板的重要組成部分，也是影響組織構(gòu)建最關(guān)鍵的因素之一，用于組織修復(fù)再生的支架材料必須同時(shí)具有生物活性和生物可控降解性[15]。將細(xì)胞與三維多孔的支架材料聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建組織是組織工程的基本方法[16，17]。人體細(xì)胞的微生態(tài)環(huán)境主要是它分泌的ECM和信號分子等有機(jī)生物活性物質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞生長的環(huán)境，調(diào)控細(xì)胞的正常代謝及遷移、增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動(dòng)。研究細(xì)胞－生物材料的生物學(xué)界面（Biointerface）是深入探索構(gòu)建組織工程化半月板的本質(zhì)和基礎(chǔ)，也是進(jìn)一步從仿生角度研發(fā)組織工程半月板支架材料的重要內(nèi)容。其生物學(xué)界面反應(yīng)是材料表面及降解產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化對細(xì)胞微生態(tài)環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞行為和分子水平功能蛋白基因表達(dá)的變化[18]。針對當(dāng)前生物材料和組織工程支架急需提高生物活性、可控降解性和促進(jìn)再生功能性等研究的熱點(diǎn)問題，本課題研制了一種新型組織工程半月板支架——?dú)ぞ厶?聚磷酸鈣復(fù)合材料。殼聚糖結(jié)構(gòu)單元氨基葡萄糖與細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖類似結(jié)構(gòu)，能與生長因子、受體和粘連蛋白產(chǎn)生許多特異相互作用，并可調(diào)控生物活性分子釋放，殼聚糖中大量自由氨基的存在使其表面具有很強(qiáng)的吸附作用，有利于細(xì)胞的粘附。通過對聚磷酸鈣制備工藝的研究，建立了計(jì)算聚合度的數(shù)學(xué)模型，其分子主鏈為“-P-O-P-”鍵，在結(jié)構(gòu)上仿生物活化能ATP的高能磷酸鍵[19]；體外與半月板細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，該鍵的斷裂為細(xì)胞生長提供了能量，明顯促進(jìn)半月板細(xì)胞的粘附和生長。因此，不同配比CS/CPP復(fù)合材料中，隨著CPP含量增加，半月板細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)呈逐漸增多的趨勢；其中3:7的CS/CPP支架材料上半月板細(xì)胞數(shù)目最多，接近覆蓋整個(gè)支架表面，生長極其旺盛，連接緊密，融合成片，細(xì)胞外基質(zhì)分泌也最多。再者，CPP降解過程中產(chǎn)生的鈣離子，可能參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用和信號分子的傳遞，細(xì)胞識別與粘合的分子機(jī)制主要通過細(xì)胞粘附因子介導(dǎo)細(xì)胞間或與細(xì)胞微生態(tài)環(huán)境間相互識別與結(jié)合，多數(shù)細(xì)胞粘附因子作用依賴鈣離子，存在鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，因此含CPP較多的復(fù)合材料更有利于半月板細(xì)胞的粘附，但目前CPP降解過程中產(chǎn)生的鈣離子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。

綜上所述，我們探索使用一種天然材料海藻酸鈉來源研制的新型生物交聯(lián)劑ADA，采用化學(xué)交聯(lián)固化法，將CS、ADA和CPP有機(jī)結(jié)合起來，制備一種新型多孔半月板組織工程支架材料，觀察半月板細(xì)胞在不同配比的CS/CPP支架材料上的生長、增殖狀況，結(jié)果顯示:三維多孔的CS/CPP復(fù)合材料能促進(jìn)半月板細(xì)胞的粘附、生長，其中3:7的CS/CPP支架材料細(xì)胞相容性和生物活性最好，最適于半月板纖維軟骨細(xì)胞粘附和生長，并能促進(jìn)半月板細(xì)胞增殖和維持其表型，有望成為組織工程半月板良好的支架載體。

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