劉文鋒 湯長發(fā) 印大中 瞿樹林 龔曉明

1 湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （湖南長沙 410012）

2 湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

低氧訓(xùn)練是利用缺氧的特殊環(huán)境，使機(jī)體氧運(yùn)輸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等產(chǎn)生多種運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)變化。其中，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，并能強(qiáng)烈促進(jìn)新血管形成、毛細(xì)血管新生，是心肌在組織水平上適應(yīng)低氧、維持和提高機(jī)能的重要機(jī)制之一[1]。熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）是目前研究較多的一種細(xì)胞保護(hù)蛋白，環(huán)境溫度升高、運(yùn)動(dòng)等均可誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)的強(qiáng)弱與組織細(xì)胞的受損程度有關(guān)[2]。當(dāng)細(xì)胞遇到病理性相關(guān)因素導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損傷、聚焦變性等有害應(yīng)激時(shí)，分子伴侶啟動(dòng)相關(guān)功能對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，增強(qiáng)機(jī)體對多種應(yīng)激源引起的損傷的適應(yīng)能力，其中HSP72屬于誘導(dǎo)型HSP70[3]。許多研究表明，在包括高熱、低氧缺血和再灌注等細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，若沒有熱休克蛋白的保護(hù)作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。Matsumori[5]研究表明 HSP70 保護(hù)心臟冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血管平滑肌舒張功能，認(rèn)為HSP70的內(nèi)皮保護(hù)功能是其保護(hù)缺血心肌的重要保護(hù)機(jī)制。由于不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間對心肌細(xì)胞HSP70的表達(dá)影響不同，研究如何調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)途徑來預(yù)防和治療運(yùn)動(dòng)性心肌損傷成為重要的課題。Bussolati等[6]在活體內(nèi)發(fā)現(xiàn)VEGF誘導(dǎo)了HSP32的表達(dá)。Chiara等[7]將 VEGF、HSP（70與32分別）與氯化血紅素（hemin）結(jié)合施加到豬內(nèi)皮細(xì)胞，作用24 h后發(fā)現(xiàn)，減少了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而表明，這些分子可能通過不同的通路發(fā)生了協(xié)同效應(yīng)。HSP70與VEGF兩者相互作用是個(gè)值得研究的課題。低氧與訓(xùn)練結(jié)合均發(fā)揮了各自的優(yōu)勢，低氧濃度、低氧方式等不同對機(jī)體的影響不同。本實(shí)驗(yàn)采用模擬不同海拔高住低練的應(yīng)激模型，了解大鼠心肌保護(hù)性蛋白VEGF和HSP70的表達(dá)情況，為揭示其分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制和科學(xué)低氧訓(xùn)練提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組

健康2月齡SD（Sprague-Dawley）大鼠48只，體重（200±11.31）g，購自長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部，證號:湘scxk 2009-003。實(shí)驗(yàn)室溫度20～23℃，相對濕度為45%～55%；以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)大鼠，自由飲水，并保持每天換飲水和加足飼料。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組:常氧對照組（C）、14.5%O2低氧暴露組（14.5%O2LH）、12.7%O2低氧暴露組（12.7%O2LH）、常氧訓(xùn)練組（TL）、14.5%O2高住低練組（14.5%O2HiLo）、12.7%O2高住低練組（12.7%O2HiLo），每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 低氧處理

采用美國Hypoxic公司的低氧裝置（由低氧發(fā)生器和密封帳篷連接組成）進(jìn)行低氧實(shí)驗(yàn)。依分組在常氧（20.9%氧濃度，平原地區(qū)）、14.5%氧濃度（相當(dāng)于海拔高度2800 m）和12.7%氧濃度（相當(dāng)于海拔高度4000 m）三種不同氧濃度適應(yīng)1周后，兩個(gè)單純低氧暴露組每天在低壓氧艙中暴露22 h后2 h艙外常氧活動(dòng)；兩個(gè)高住低練組每天在低壓氧艙中暴露22 h后1 h常氧生活，然后1 h常氧訓(xùn)練。所有進(jìn)行低氧暴露的動(dòng)物每周實(shí)驗(yàn)6天，共4周。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排

適應(yīng)喂養(yǎng)3天后，采用杭州立泰科技有限公司PT實(shí)驗(yàn)動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行一次5～10 min適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為16 m/min，坡度為0。正式實(shí)驗(yàn)期間，每天訓(xùn)練速度為35 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間從30 min至60 min遞增，每3天增加5 min。每天訓(xùn)練1次，每周6天，周六休息1天，共訓(xùn)練4周。

1.3 標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，用100 g/L水合氯醛麻醉大鼠（600 mg/kg），大鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，暴露胸腔，迅速取一小塊心尖部位的心肌置于包埋盒，放入4%多聚甲醛緩沖溶液（0.1M，pH7.4）中，固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、進(jìn)蠟、包埋等，用于VEGF和HSP70免疫組織化學(xué)標(biāo)本制作。

1.4 VEGF和HSP70的免疫組織化學(xué)檢測

將石蠟切片脫蠟脫水；用3%H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；微波爐修復(fù)抗原，PBS液沖洗5 min×3次；用5%～10%山羊血清室溫孵育10 min；滴加一抗（1:50，兔源VEGF和HSP70多克隆抗體，購自武漢博士德生物試劑有限公司），置4℃冰箱過夜；室溫孵育15 min，PBS液沖洗5 min×3次；滴加二抗（PV6001/6002二步法免疫組化檢測試劑，購自武漢博士德生物試劑有限公司），37℃恒溫箱中孵育30 min（烤片），PBS液沖洗5 min×3次；采用終濃度為0.05%DAB-0.03%H2O2的顯色劑顯色4～5 min，PBS液充分沖洗，蘇木素常規(guī)染色4～5 min，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒；烘干，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為空白對照。

1.5 形態(tài)學(xué)計(jì)量（morphometry）

顯微鏡下大鼠心肌VEGF和HSP70免疫組織化學(xué)陽性物質(zhì)著色為黃褐色。每組選片10張，鏡下（×400）每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行分析。用Simple PCI 6.0計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)分析免疫組化陽性產(chǎn)物灰度值。采用陽性指數(shù)（positive index，PI）作為VEGF和HSP70陽性產(chǎn)物表達(dá)量，陽性指數(shù)=陽性強(qiáng)度光密度值×陽性反應(yīng)面積/測量面積[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；低氧暴露、常氧訓(xùn)練組和高住低練組各組間顯著性差異采用方差分析，兩低氧暴露組和兩高住低練組組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，顯著性水平為 = 0.05，Ρ< 0.05具有顯著性差異，Ρ< 0.01具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)

圖1顯示，鏡下大鼠心肌VEGF免疫組織化學(xué)陽性物質(zhì)著色為黃褐色，著色區(qū)域主要在心肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜或細(xì)胞漿中。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。C組、14.5%O2LH組和12.7%O2LH組，陽性著色面積較小，顏色較淺，胞核不著色；14.5%O2HiLo組VEGF陽性面積較大，顏色呈深褐色，呈區(qū)域性分布，主要分布在心肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜或細(xì)胞漿中，甚至細(xì)胞核也著色；但12.7%O2HiLo組陽性表達(dá)的陽性物質(zhì)顏色變淺，染色分布較均勻，無著色很明顯的區(qū)域。

表1顯示，與C組比較，兩LH組、TL組和兩HiLo組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量均有所增加，除12.7%O2LH組外，其他各組表達(dá)顯著增加（Ρ< 0.05， < 0.01）；與TL組相比，兩HiLo組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加（Ρ< 0.05）；與兩LH組相比，兩HiLo組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加（Ρ< 0.05）；14.5%O2LH組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量較12.7%O2LH組顯著增加（Ρ< 0.05），12.7%O2HiLo組比14.5%O2HiLo組顯著降低（Ρ<0.05），14.5%O2HiLo組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量較14.5%O2LH組顯著增加（Ρ< 0.05），14.5%O2HiLo組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量較12.7%O2LH組顯著增加（Ρ< 0.05）。

表1 各組大鼠心肌VEGF免疫組織化學(xué)分析陽性指數(shù)和表達(dá)面積結(jié)果

2.2 各組大鼠心肌HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)

圖2顯示，鏡下大鼠心肌HSP70免疫組織化學(xué)陽性物質(zhì)呈顆粒狀，染色為黃褐色，著色區(qū)域主要在細(xì)胞核仁周圍的細(xì)胞漿中，正常細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。C組著色較淺，分布均勻，TL組與之相當(dāng)；兩LH組和兩HiLo組HSP70陽性表達(dá)面積明顯增大，顏色呈深褐色，著色區(qū)域主要分布在胞核周圍地帶，細(xì)胞漿著色較均勻；12.7%O2比14.5%O2的HSP70陽性表達(dá)增加，細(xì)胞核及周圍染色增加，但低氧暴露組HSP70陽性表達(dá)與低氧訓(xùn)練組之間相當(dāng)，區(qū)分度不明顯。

表2顯示，與C組相比較，兩LH組和兩HiLo組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量均有所增加（Ρ<0.05），其中，12.7%O2LH組表達(dá)最明顯，而TL組增加不顯著（Ρ> 0.05）；與TL組相比，兩HiLo組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加（Ρ< 0.05）；與LH組相比，12.7% O2HiLo組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加（Ρ< 0.05），而14.5% O2HiLo組表達(dá)量增加不顯著（Ρ> 0.05）；14.5% O2LH和HiLo兩組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量分別比12.7%O2LH和HiLo兩組顯著降低（Ρ< 0.05），而兩LH組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量分別與兩HiLo組相比無顯著性差異（Ρ> 0.05）。

表2 各組大鼠心肌HSP70免疫組織化學(xué)分析陽性指數(shù)和表達(dá)面積結(jié)果

3 討論

3.1 模擬不同海拔高住低練對大鼠心肌VEGF的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，14.5%O2低氧暴露組，12.7%O2兩高住低練組的VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量增加（Ρ<0.05），而14.5%O2高住低練組表達(dá)增加非常顯著（Ρ< 0.01）。Hudlicka等[9]報(bào)道，高原適應(yīng)后的心率下降與心臟毛細(xì)血管增生有關(guān)。影響毛細(xì)血管增生的因素中，VEGF是一種能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的、強(qiáng)促細(xì)胞分裂素和促血管生成因子，由低氧誘導(dǎo)，是目前最重要的促血管增生的因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常氧運(yùn)動(dòng)組的VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加（Ρ< 0.05）。研究發(fā)現(xiàn)耐力訓(xùn)練可促進(jìn)心肌毛細(xì)血管的增生，毛細(xì)血管密布也增加，毛細(xì)血管的增生可增加心臟的血氧供應(yīng)，是心臟對耐力訓(xùn)練良好適應(yīng)的表現(xiàn)[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12.7%O2低氧暴露組VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)量較14.5%O2低氧暴露組顯著降低，12.7%O2高住低練組表達(dá)量較14.5%O2高住低練組顯著降低。這表明低氧和運(yùn)動(dòng)的交互效應(yīng)與單純低氧誘導(dǎo)VEGF陽性物質(zhì)表達(dá)不同。翁錫全等[11]的研究結(jié)果表明，常壓下不同低氧環(huán)境模擬高住低練對大鼠心肌VEGF mRNA表達(dá)作用結(jié)果不同，常壓下14.5%氧含量（相當(dāng)于海拔3000 m）模擬高住低練能誘導(dǎo)VEGF上調(diào)，而在常壓下12.6%氧含量（相當(dāng)于海拔4000 m）模擬高住低練時(shí)VEGF mRNA基因表達(dá)量卻減少。其訓(xùn)練模型不同于本實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)在低氧濃度相同但低氧持續(xù)時(shí)間不同，但得到的結(jié)果類似，表明低氧訓(xùn)練中，隨著海拔高度增加，低氧刺激對VEGF的影響更加明顯，但海拔高度過高，如4000 m高度可能不利于VEGF表達(dá)，如本實(shí)驗(yàn)中12.7%O2低氧暴露組VEGF增加則不明顯，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 模擬不同海拔高住低練對大鼠心肌HSP70的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，14.5%O2和12.7%O2的低氧暴露和高住低練均能誘導(dǎo)HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加。HSP70有非常廣泛的應(yīng)激保護(hù)作用，研究已經(jīng)闡明，低氧、運(yùn)動(dòng)和低氧運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，從而對心臟起一定的保護(hù)作用，增強(qiáng)缺血后心肌功能的恢復(fù)[12，13]。本實(shí)驗(yàn)中，常氧訓(xùn)練組HSP70有所增加。胡亞哲等[14]研究表明，心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)在有氧訓(xùn)練后發(fā)生適應(yīng)性改變，心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)增加；過度訓(xùn)練后則發(fā)生病理性改變，心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)較有氧訓(xùn)練組亦顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常氧訓(xùn)練組相比，兩高住低練組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量顯著增加，表明低氧促進(jìn)了HSP70表達(dá)；14.5%O2低氧暴露和14.5%O2高住低練兩組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量比12.7%O2低氧暴露和12.7%O2高住低練兩組明顯降低，表明不同低氧濃度誘導(dǎo)的HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)不同；而兩低氧暴露組HSP70陽性物質(zhì)表達(dá)量與兩高住低練組無顯著性差異，表明低氧與訓(xùn)練未形成交互效應(yīng)。魏勇等[15]提出運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的體溫升高使線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，產(chǎn)生氧自由基和H2O2，誘導(dǎo)了HSP合成表達(dá)。同時(shí)，其他研究也認(rèn)為運(yùn)動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致的HSP70合成可能與運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變有關(guān)。概言之，運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體內(nèi)環(huán)境變化，包括高熱、鈣離子和pH值改變、缺氧、組織損傷后炎癥介質(zhì)釋放及自由基生成等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能改變和蛋白質(zhì)變性損傷，從而誘導(dǎo)HSP表達(dá)，并可能與能量耗竭有關(guān)。

4 總結(jié)

單純低氧暴露、常氧運(yùn)動(dòng)及高住低練三種應(yīng)激因素均誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性蛋白VEGF和HSP70表達(dá)；14.5%O2HiLo組VEGF表達(dá)最顯著，而12.7%O2LH組HSP70表達(dá)最顯著。

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