屈長(zhǎng)青，徐林麗，陸 娟，姬云濤

(1.阜陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽(yáng) 236041)

羅勒(Ocimum basilicum)是唇形科羅勒屬植物，也被稱為九層塔、金不換等，原生于亞洲熱帶區(qū)，國(guó)內(nèi)多栽培于安徽和河南等地，其他各省開發(fā)利用較少［1］?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，羅勒主要含有揮發(fā)油類、黃酮及其苷類、香豆素類，此外還含有三萜類和生物堿類等成份［2］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)羅勒對(duì)頭痛、鼻竇炎、支氣管炎、袪痰、傷風(fēng)感冒、氣喘、打嗝、脹氣、肌肉酸痛、皮膚松軟等都有不同程度療效［3］。近年來(lái)，已有關(guān)于羅勒抗血栓形成、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抗氧化、降血脂和降血糖等作用的報(bào)道［4］，但羅勒對(duì)脂肪沉積的影響尚未見報(bào)道。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)屬于線形動(dòng)物門、線蟲綱動(dòng)物，因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、通體透明、生命周期短和易于培養(yǎng)，而被用作為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、抗衰老及脂肪調(diào)控等方面研究的理想模式生物，線蟲中的許多重大發(fā)現(xiàn)為人們理解復(fù)雜的細(xì)胞生命活動(dòng)做出了極大的貢獻(xiàn)［5］。近年來(lái)，也有用其進(jìn)行藥物篩選的報(bào)道［6］。本實(shí)驗(yàn)通過用羅勒水提物配制的NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)羅勒水提物可以減少線蟲體內(nèi)脂質(zhì)含量，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

1 材料

1.1 秀麗隱桿線蟲及食物

N2野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegans，the Bristol strain N2)及大腸桿菌OP50由中科院等離子體物理研究所吳李君研究員惠贈(zèng);大腸桿菌OP50是尿嘧啶滲漏突變型，作為線蟲的食物。

1.2 藥品及試劑

種子培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基和各種緩沖液的配制參照文獻(xiàn)［7］。

裂解液:每100mL水中含有5 mol/L KOH溶液10mL和10%次氯酸鈉溶液10mL。

2 方法

2.1 羅勒水提物與NGM培養(yǎng)基的配制

稱取羅勒粉末10 g于水200mL中，浸泡過夜，次日過濾，取濾液配制NGM培養(yǎng)基。對(duì)照組中用等量水配制NGM培養(yǎng)基。

2.2 大腸桿菌(E.coil)的培養(yǎng)與接種

將OP50單菌落接種于B.broth培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。吸取OP50菌液于NGM平板中央，再用滅菌的玻璃棒輕輕涂布使菌液均勻分散占整個(gè)培養(yǎng)皿面積的2/3左右，于37℃培養(yǎng)12 h。

2.3 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)及同步化

將秀麗隱桿線蟲接入培養(yǎng)好大腸桿菌的NGM平板，于20℃培養(yǎng)2～3 d;用M9沖洗培養(yǎng)平板，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1mL EP管中，加入裂解液裂解蟲體，獲得卵溶液;劇烈振蕩混勻蟲體，點(diǎn)動(dòng)離心收集卵;用M9緩沖液沖洗3次后，卵置于M9溶液中25℃條件下孵化12 h，獲得同步化一齡幼蟲(L1)，然后將同步化的L1幼蟲轉(zhuǎn)移到已培養(yǎng)好OP50的NGM平板中，25℃培養(yǎng)30 h，發(fā)育成四齡幼蟲(L4)。

2.4 蟲體油紅O染色

參照本實(shí)驗(yàn)室的方法［8］，將同步化的秀麗隱桿線蟲接入培養(yǎng)好大腸桿菌的NGM平板，培養(yǎng)3 d后，用M9緩沖液從培養(yǎng)平板中各沖洗出50條至1mL EP管中，4%多聚甲醛室溫固定15～30 min后，置于－80℃冰箱中冷凍15 min，43℃水浴解凍。低速離心1 min，棄上清。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。棄去PBS，用0.1%Triton X-100、油紅O溶液浸泡30 min。用PBS沖洗3次，異丙醇分化。

2.5 蟲體裂解

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組EP管中分別加入裂解液，線蟲全部裂解后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。A值反應(yīng)細(xì)胞脂質(zhì)變化，從而判斷脂肪細(xì)胞中脂滴含量。

3 結(jié)果

3.1 蟲體染色觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察，用1%Triton X-100和油紅O聯(lián)合處理30 min的線蟲體內(nèi)有明顯的油紅O著色現(xiàn)象，而沒有處理的則為透明的(圖1)。

圖1 光鏡下觀察秀麗隱桿線蟲

3.2 羅勒水提物對(duì)線蟲脂肪沉積的影響

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的A值(n=3)分別為(0.017±0.009)和(0.026±0.002)，實(shí)驗(yàn)組A 值明顯降低，與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01)，說明羅勒水提物可抑制線蟲體內(nèi)的脂肪沉積。

4 討論

目前油紅O被認(rèn)為是一種優(yōu)良的脂肪染色染料［9］。為取得較好的染色效果，本實(shí)驗(yàn)先用多聚甲醛對(duì)線蟲進(jìn)行固定，隨后用Triton X-100和油紅O共同處理線蟲，獲到了較好的染色效果。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑，它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性，在Triton X-100的透化作用下，油紅O可以有效進(jìn)入線蟲體內(nèi)進(jìn)行著色。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，線蟲在羅勒水提物配制的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，經(jīng)油紅O染色并裂解后，其吸光度值小于對(duì)照組，說明其脂質(zhì)含量較少，提示羅勒可抑制脂肪沉積，減少線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)含量，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。目前，本實(shí)驗(yàn)室正進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)和分子機(jī)制研究，如果將其作用機(jī)理探究清楚，可為進(jìn)一步開發(fā)利用羅勒提供理論依據(jù)。

［1］毛同艷，劉淑平，李文閣.羅勒露地栽培技術(shù)與利用［J］.種子世界，2003，10:28-29.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1354.

［3］吳冬乾，夏月明，朱玉萍.羅勒的實(shí)用栽培技術(shù)［J］.上海蔬菜，2005(2):39.

［4］周緒霞，李衛(wèi)芬.羅勒的應(yīng)用與展望［J］.獸藥與飼料添加劑［J］.2003，8(2):25-27.

［5］秦峰松，楊崇林.小線蟲，大發(fā)現(xiàn):Caenorhabditis elegans在生命科學(xué)研究中的重要貢獻(xiàn)［J］.生命科學(xué)，2006，18(5):419-424.

［6］楊再昌，楊小生.秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)在藥物篩選中的應(yīng)用［J］.生命科學(xué)，2009，21(4):593-598.

［7］Stiernagle，T.Maintenance of C.elegans［M］.Oxford University Press，2006:1-11.

［8］姬云濤，王亦舒，李星辰，等.秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂滴的油紅O染色觀察［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(2):141-142.

［9］屈長(zhǎng)青，李東偉，朱茂英.一種改進(jìn)的培養(yǎng)脂肪細(xì)胞染色法［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，17(3):329-330.