于瑞蓮，許金國，顧曉娟

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild.)是一年生披散草本，屬茜草科(Rubiaceae)耳草植物的全草，廣泛分布于亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于長江流域以南的廣東、廣西、福建等地。主要用于清熱解毒、利尿消腫、止痛抗菌、活血止痛。民間常用此藥內(nèi)服，治療小兒疳疾、毒蛇咬傷、癌腫及腸道疾病。外用治各種瘡瘍及跌打刀傷等癥;為治療腸癰、肝炎、泌尿系統(tǒng)感染等病的有效中藥。

白花蛇舌草化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)了多糖［1］、黃酮甙車葉草甙和3個(gè)環(huán)烯萜類化合物、熊果酸、齊墩果酸等多種化合物［2］。藥理研究表明其具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能，保肝利膽，抗菌消炎等作用。近年來通過大量臨床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)本品有很好的抗腫瘤作用，臨床廣泛用于治療多種惡性腫瘤［3-4］。

本實(shí)驗(yàn)利用從白花蛇舌草種子培育的試管苗的莖尖，建立了愈傷組織及懸浮細(xì)胞系，系統(tǒng)研究了其懸浮細(xì)胞系的建立與生長規(guī)律，從而為大規(guī)模培養(yǎng)提供了大量的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

白花蛇舌草種子由本校藥用植物教研室提供;白花蛇舌草愈傷組織由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)選育。

1.2 細(xì)胞懸浮系的建立

愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)［5］:取白花蛇舌草試管苗的莖尖接種于MS+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)4.0mg/L+Kt(激動(dòng)素)0.5mg/L［5］+3% 蔗糖的培養(yǎng)基，將莖尖的愈傷組織轉(zhuǎn)接，進(jìn)行繼代培養(yǎng)2～3次，每20 d繼代1次，采用100mL錐形瓶，裝液量50mL，0.8% 瓊脂粉固化，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度保持(26±1)℃。

懸浮細(xì)胞系的建立與培養(yǎng)［6］:將繼代培養(yǎng)15～20 d的生長均勻、質(zhì)地松散、淡黃色半透明狀愈傷組織2 g，置于含1mg/L NAA(α-萘乙酸)和3%蔗糖的液體培養(yǎng)基50mL中進(jìn)行首次懸浮培養(yǎng)7～10 d后，以10%的接種量加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行第二代培養(yǎng)(以下各代均相同)，置旋轉(zhuǎn)搖床上，溫度(26±1)℃暗培養(yǎng)，120 r/min下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。定期觀察培養(yǎng)液內(nèi)懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的生長變化，觀測數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，建立懸浮細(xì)胞生長曲線。

以上所有實(shí)驗(yàn)如無特殊說明，均采用高壓蒸汽滅菌法，溫度控制在121～122℃，氣壓在103.421 kPa，滅菌30～40 min。

1.3 懸浮細(xì)胞生長的測定

采用500mL錐形瓶，裝液量250mL，培養(yǎng)基為MS+NAA 0.3mg/mL，且初始 pH 值為5.8～6.0，接入20%接種量的白花蛇舌草細(xì)胞種子液，置旋轉(zhuǎn)搖床上，培養(yǎng)溫度(26±1)℃，120 r/min振蕩暗培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)結(jié)束后取細(xì)胞液40mL，4 000 r/min，離心20 min后倒盡上清液，稱重，將收集的培養(yǎng)物置于60℃ 烘箱中烘干至恒重，作為干重，換算成每1 L培養(yǎng)基的細(xì)胞干重克數(shù)，表示細(xì)胞生長量。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

1.4 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液樣品的制備

白花蛇舌草懸浮細(xì)胞以15%的接種量，用旋轉(zhuǎn)式搖床以120 r/min、(26±1)℃進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，15 d后取培養(yǎng)液，10 000 r/min離心10 min后，取上清液備用。

1.5 接種量的測定

在添加了NAA 0.1mg/mL、蔗糖30 g/L且初始pH值為5.8～6.0的MS培養(yǎng)液中，分別接入10%，15%，20%，25%，30%接種量的白花蛇舌草細(xì)胞。在光照條件下培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)結(jié)束后，在孔徑0.4μm的濾網(wǎng)上減壓抽濾后稱其鮮重，然后將收集培養(yǎng)物置60℃ 烘箱中烘干至恒重，作為干重，換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細(xì)胞干重克數(shù)，表示細(xì)胞生長速率。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

1.6 pH 測定

用精密pH計(jì)進(jìn)行測定。

1.7 蔗糖含量測定

采用間苯二酚法，方法參見文獻(xiàn)［7］。

以蔗糖為對照品，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=2.058 3 C －0.026 5，r=0.995 1，其中A 為在480 nm波長的吸光度值，C為蔗糖濃度(mg/L)，線性范圍為0.024 4～0.544mg/L。

將細(xì)胞培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋后，同法測定在480 nm波長的A值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中蔗糖含量。

1.8 ［］含量的測定

方法見參考文獻(xiàn)［7-8］。以硫酸銨為對照品，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.030 7 C －0.012 3，r=0.995 9，其中A為480 nm波長處的吸光度值，C為硫酸銨濃度(mg/L)。

將細(xì)胞培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋后，同法測定在480 nm波長處的A值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中硫酸銨含量。

1.9 ［］含量測定

方法見參考文獻(xiàn)［7，9］。以硝酸鉀為對照品，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.260 8 C+0.011 5，r=0.991 9，其中A為360 nm波長處的吸光度值，C為硝酸鉀濃度(mg/L)。

將細(xì)胞培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋后，同法測定在360 nm波長處的A值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中［］含量。

1.10 多糖含量測定

采用苯酚硫酸法［10］。實(shí)際產(chǎn)生的多糖為總糖減去殘余蔗糖的量。以葡萄糖為對照品，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=9.168 8 C+0.002 3，r=0.998 8，其中A為490 nm波長處的吸光度值，C為葡萄糖濃度(mg/L)。

將細(xì)胞培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋后，同法測定在490 nm波長處的A值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中多糖含量。

2 結(jié)果

2.1 接種量測定

由圖1可以看出，當(dāng)接種量達(dá)到15%時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大值，接種量繼續(xù)增大，細(xì)胞干重會(huì)大幅降低，在接種量到25%之后，細(xì)胞干重變化不大。

圖1 白花蛇舌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中不同接種量的細(xì)胞干重變化Fig.1 Effect of innocation amount in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.2 細(xì)胞生長的周期變化

由圖2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到9 d時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大值，以后的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞干重會(huì)略有減少。

圖2 白花蛇舌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中細(xì)胞干重周期變化Fig.2 Changes of CDW in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗變化

由圖4可以看出，隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，pH很快減少，大約在9 d后就達(dá)到pH 3左右，說明在培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞液中大量產(chǎn)生酸，或有生理酸性鹽被利用，但如果只是生理酸性鹽被利用而引起的pH降低，則pH不會(huì)降低這么多，說明還是有酸性物質(zhì)被生成。

培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分碳源——蔗糖，在培養(yǎng)開始時(shí)，有比較大的降低，在培養(yǎng)后期，細(xì)胞干重不再增加時(shí)，也不再有大的改變。

由圖4可以看出，隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，多糖起先增加不是很多，隨培養(yǎng)的進(jìn)行，在培養(yǎng)后期，逐漸大量生成，說明它和細(xì)胞的生長屬于非偶聯(lián)型。圖4中最終多糖的濃度為25 g/L，蔗糖的濃度18 g/L，兩者之和為43 g/L，高于蔗糖的初始濃度30 g/L，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中含有的其它含碳物質(zhì)也參與到了多糖的合成中。

圖3 白花蛇舌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中［］和［］周期變化Fig.3 Change of［］in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

圖4 白花蛇舌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中pH和多糖周期變化Fig.4 Change of pH and polysaccharide sustain cell suspension culture of Hedyotic diffusa

3 討論

在白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，最大的特點(diǎn)是，細(xì)胞大量繁殖，細(xì)胞濃度不斷增大，細(xì)胞干重達(dá)到最大值，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到9 d時(shí)，pH很快減少，達(dá)到3左右，以后的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞生長減緩甚至停止，細(xì)胞出現(xiàn)衰老和凋亡，細(xì)胞干重會(huì)略有減少。說明在培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞液中大量生成酸性物質(zhì)，致使細(xì)胞的生長受到抑制，這也被以后分離實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。

在白花蛇舌草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分氮源［］說明它被細(xì)胞生長優(yōu)先于［］利用，這和在一般的微生物培養(yǎng)中的規(guī)律不太一樣。但因生酸，生長受到抑制，細(xì)胞干重增加的不多，所以減少的量有限。

培養(yǎng)液中的主要營養(yǎng)成分碳源——蔗糖，在培養(yǎng)開始時(shí)，有比較大的降低，在培養(yǎng)后期，細(xì)胞干重不再增加時(shí)，也不再有大的改變。細(xì)胞液中多糖的量，隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，多糖起先增加不是很多，隨培養(yǎng)的進(jìn)行，在培養(yǎng)后期，逐漸大量生成，說明它和細(xì)胞的生長屬于非偶聯(lián)型。

因白花蛇舌草懸浮細(xì)胞系生長迅速，極具工業(yè)化潛力，本研究結(jié)果可為以后的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

［1］吳厚銘，黃勝余，勞霞飛，等.白花蛇舌草免疫多糖結(jié)構(gòu)的研究［J］.有機(jī)化學(xué)，1992，12:428-431.

［2］呂華沖，何 軍.白花蛇舌草化學(xué)成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，18(1):34-37.

［3］單保恩，張金艷，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫學(xué)調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21(5):370-374.

［4］譚寧華，王雙明.白花蛇舌草抗腫瘤活性和成分［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，4(5):33-36.

［5］巢建國，談獻(xiàn)和，張 瑜，等.白花蛇舌草組織培養(yǎng)研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(6):369-370.

［6］于瑞蓮，巢建國，許金國.白花蛇舌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立與條件優(yōu)化［J］.海峽藥學(xué)，2006，18(6):132-134.

［7］湯章城，魏家綿，陳 因，等.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:北京科學(xué)出版社，1999:99-101.

［8］馬 悅，朱貽華，趙東玲，等.利用Berthelo顏色法測定發(fā)酵液中銨離子的干擾排除［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，32(3):282-284.

［9］劉振民，姜 智.間苯二酚法快速測定水中硝酸鹽氮的探討［J］.環(huán)境與健康雜志，1988，5(5):27-28.

［10］張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔纾?987.