謝 德，華子春

(南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093)

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，可以治療多種癌癥，但副作用很大，希望通過與靶向分子偶聯(lián)的方法，可以降低它的用藥量和增加治療效果。Annexin V是一種人體內(nèi)源性蛋白，屬于Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，能與凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結(jié)合，具有抗凝及抗炎作用，近年還發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用［1］。在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞會產(chǎn)生表面富含PS的微泡，微泡中含有可以促進(jìn)腫瘤血管新生的表皮生長因子受體(EGFR)等物質(zhì)。Annexin V通過阻止這些微泡與腫瘤血管上皮細(xì)胞的融合，從而抑制了腫瘤血管新生和腫瘤的生長［1］。這種微泡的產(chǎn)生機(jī)制不明，但從微泡的特性來看，我們推測腫瘤細(xì)胞的PS外翻應(yīng)該是這種微泡形成的必經(jīng)過程，并且在腫瘤組織中確有很多細(xì)胞的PS是外翻的，而正常組織細(xì)胞的表面很少有PS暴露出來。Annexin V蛋白在體內(nèi)可以與PS外翻的腫瘤細(xì)胞結(jié)合［2］。以Annexin V作為靶向分子的偶聯(lián)藥物，目前還未見報道。本研究選擇EDC/sulfo-NHS為偶聯(lián)劑，將阿霉素的氨基偶聯(lián)到Annexin V的羧基上［3］，對二者偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)條件作了初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鹽酸阿霉素(CAS:25316-40-9)購自南京康滿林公司;Annexin V蛋白為本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)、純化［4］;2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)購自Sigma公司;人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì);Eppendorf Centrifuge 5810R離心機(jī);TECAN SAFIRE自動酶標(biāo)儀;Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀。

1.2 阿霉素與Annexin V偶聯(lián)物的制備

將Annexin V凍干粉2mg溶解于含有0.05 mol/L MES、0.5 mol/L NaCl的緩沖液(pH 6.0)2mL中，加入EDC，使其終濃度在6 mmol/L，加入sulfo-NHS，使其終濃度在5～15 mmol/L，混勻后室溫反應(yīng)15 min。然后加入2-巰基乙醇(20 mmol/L)反應(yīng)10 min，以中和未反應(yīng)的偶聯(lián)劑。用截留分子質(zhì)量為10 kD的超濾管離心濃縮中間產(chǎn)物。將鹽酸阿霉素3mg溶解于0.1 mol/L 磷酸鈉溶液(pH 7.5)1.6mL中，再將超濾管濃縮的中間產(chǎn)物與阿霉素溶液混合，室溫下攪拌2 h。反應(yīng)后，體系中產(chǎn)生的沉淀用含8 mol/L尿素的0.1 mol/L磷酸鈉溶液(pH 8.0)溶解。然后使用0.1 mol/L磷酸鈉溶液(pH 7.5)稀釋產(chǎn)物溶液，用超濾管超濾濃縮，重復(fù)稀釋、濃縮操作4次，直至濾過液中檢測不到阿霉素為止。

1.3 偶聯(lián)產(chǎn)物的表征

以0.1 mol/L磷酸鈉溶液做參比溶液，分別做偶聯(lián)物、Annexin V、阿霉素、濾過液的吸收光譜分析，掃描波長范圍為200～600 nm。偶聯(lián)物中阿霉素的濃度根據(jù)朗伯-比爾公式計(jì)算，C阿霉素=A495/10 000，其中10 000為阿霉素在495 nm處的摩爾吸光系數(shù)［5］。Annexin V的濃度使用Bradford法測定［6］，用牛血清白蛋白溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到蛋白的摩爾濃度。阿霉素與Annexin V的偶聯(lián)比=C阿霉素/CAnnexin V。

1.4 MTT法測定偶聯(lián)產(chǎn)物對MDA-MB-231細(xì)胞的毒性作用［7］

取對數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞，加入適量的胰酶-EDTA溶液消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成混懸液，并稀釋成1×104/mL備用。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液(含2×103細(xì)胞)200μL。次日，為了模擬癌細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)，先用0.2 mmol/L的過氧化氫處理1 h，使其PS外翻，然后再加入不同濃度的偶聯(lián)物、Annexin V以及阿霉素與Annexin V的混合物，每一濃度重復(fù)做4孔。同時設(shè)無細(xì)胞組作為檢測時的背景。置于相應(yīng)的環(huán)境下培養(yǎng)72 h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液25μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出上清，加入DMSO 200μL，震蕩15 min，用酶標(biāo)儀測 A570值，存活率=(A/A0)×100%，A0為腫瘤細(xì)胞對照組吸光度值，A為藥物處理組吸光度值。偶聯(lián)物的藥物濃度以其中含有的阿霉素的濃度為準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 影響偶聯(lián)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件

由于鹽酸阿霉素在堿性溶液中溶解度比中性或酸性溶液小，所以本實(shí)驗(yàn)中所用的鹽酸阿霉素在磷酸鈉溶液中并不能完全溶解，形成阿霉素的懸濁液，阿霉素在0.1 mol/L磷酸鈉(pH 7.5)溶液中的飽和濃度為0.378 mmol/L，濃度較低，并且在反應(yīng)中一直處在飽和濃度下。而從表1可以看出，在EDC過量的情況下，sulfo-NHS的濃度對產(chǎn)物的偶聯(lián)比有著較大的影響。

表1 Sulfo-NHS濃度對偶聯(lián)物偶聯(lián)比的影響Tab.1 Effect of Sulfo-NHS'concentration on molar ratio of conjugate

由于阿霉素的疏水性，偶聯(lián)物在生成后會形成絮狀沉淀。由于在隨后的細(xì)胞試驗(yàn)中要求偶聯(lián)物必須是溶解狀態(tài)的，因此，本研究采用含有8 mol/L尿素的0.1 mol/L磷酸鈉溶液(pH 8.0)溶解，再用0.1 mol/L磷酸鈉溶液超濾，獲得了偶聯(lián)物的溶液。

2.2 偶聯(lián)物的吸收光譜

從吸收光譜(圖1)可見，偶聯(lián)物在450～550 nm波長處有一個較明顯的吸收峰，是阿霉素的特征吸收峰，而在濾過液和Annexin V溶液中則沒有這個吸收峰，說明阿霉素是偶聯(lián)在蛋白上的。

圖1 4種溶液的吸收光譜Fig.1 Spectra of four kinds of solution

2.3 MTT法檢測細(xì)胞毒性

由于Annexin V是與細(xì)胞表面的PS結(jié)合，所以在給藥前用0.2 mmol/L過氧化氫處理細(xì)胞1 h，使細(xì)胞處于早期凋亡的狀態(tài)下，這時細(xì)胞的PS外翻，可以模擬Annexin V在體內(nèi)腫瘤組織的作用。從MTT結(jié)果看，偶聯(lián)物濃度為1μmol/L時，細(xì)胞存活率已經(jīng)降為27.7%(偶聯(lián)物的濃度以其中所含阿霉素濃度為準(zhǔn))，而要達(dá)到相同的抑制率，單獨(dú)使用阿霉素則需要1.8μmol/L。Annexin V在高濃度時也顯示了一定的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，例如，Annexin V為3.88μmol/L時，細(xì)胞存活率為63.9%。圖2是4種物質(zhì)對MDA-MB-231細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 MTT法測定MDA-MB-231細(xì)胞存活率Fig.2 MTT assay of MDA-MB-231 cell survival

3 討論

Annexin V是一種膜聯(lián)蛋白，生物信息學(xué)分析顯示，它含有24個天冬氨酸，29個谷氨酸，分子表面的羧基都有可能是偶聯(lián)位點(diǎn)，其潛在的偶聯(lián)位點(diǎn)較多，所以用這種偶聯(lián)方法的位點(diǎn)特異性不強(qiáng)，有可能會造成蛋白上的PS結(jié)合位點(diǎn)被封閉，影響結(jié)合活性。因此，偶聯(lián)方法還有需要進(jìn)一步改進(jìn)之處。

通過測量阿霉素溶液的吸收光譜，計(jì)算出阿霉素在0.1 mol/L磷酸鈉溶液中的飽和濃度為0.378 mmol/L，該飽和濃度較低可能是導(dǎo)致了偶聯(lián)物偶聯(lián)比低的一個可能原因。

過氧化氫是一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力極強(qiáng)的氧化劑，本實(shí)驗(yàn)中使用0.2 mmol/L的濃度作用1 h后，可以觀察到部分細(xì)胞變圓，呈現(xiàn)早期凋亡的狀態(tài)。但在陰性對照組中洗去過氧化氫后，72 h以內(nèi)，細(xì)胞生長正常，并沒有出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，而且陰性對照組細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)的測定的結(jié)果也表明該組細(xì)胞保持較好的活力。

腫瘤組織中不光是腫瘤細(xì)胞上的PS暴露在外表面，腫瘤血管上皮細(xì)胞也有這種現(xiàn)象［2］，所以，Annexin V還可以作為靶向腫瘤血管上皮細(xì)胞的分子。有研究表明阿霉素可以破壞血管上皮細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)［8］。所以，有理由推斷，Annexin V與阿霉素的偶聯(lián)物在腫瘤血管新生可能具有較強(qiáng)的靶向抑制作用，進(jìn)而加強(qiáng)抗腫瘤效果。

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