董藝凝，陳海琴，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

耐熱β-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展

董藝凝，陳海琴，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

耐熱-半乳糖苷酶因其具有較高的作用溫度和良好的熱穩(wěn)定性，在乳制品生產(chǎn)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，其理論及應(yīng)用價(jià)值正逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。從耐熱-半乳糖苷酶的來源、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、催化機(jī)制及定向進(jìn)化研究方面綜述了耐熱-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展，并對(duì)其應(yīng)用及研究前景進(jìn)行了展望。

耐熱-半乳糖苷酶，結(jié)構(gòu)特征，催化機(jī)制，定向進(jìn)化

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23，俗稱乳糖酶）可催化半乳糖苷鍵（β-D-galactosyl bond）的水解。β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中有兩項(xiàng)主要的應(yīng)用，一是水解乳中的乳糖，二是用于功能性食品中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides）的合成。耐熱β-半乳糖苷酶沒有嚴(yán)格的定義，它是相對(duì)于常溫微生物來源的β-半乳糖苷酶界定的，一般把最適溫度在50℃以上的β-半乳糖苷酶稱作耐熱β-半乳糖苷酶。近年來，耐熱β-半乳糖苷酶在乳制品生產(chǎn)中具有顯著的優(yōu)勢(shì)，并逐漸引起人們的研究興趣。本文主要綜述了耐熱β-半乳糖苷酶的研究現(xiàn)狀，以期為耐熱β-半乳糖苷酶研究發(fā)展開拓思路。

1 耐熱β-半乳糖苷酶的來源及酶學(xué)性質(zhì)

耐熱β-半乳糖苷酶主要來源于一些高溫菌和中溫細(xì)菌，如耐熱嫌氣菌、棲熱菌、嗜熱菌和古細(xì)菌等。真菌中霉菌乳糖酶也具有較高作用溫度，但酵母菌中未見報(bào)道。表1列舉了幾種不同微生物來源的耐熱β-半乳糖苷酶及其酶學(xué)性質(zhì)。其中，嗜熱細(xì)菌是耐熱β-半乳糖苷酶的一個(gè)重要來源，嗜熱細(xì)菌生長(zhǎng)溫度一般在55～65℃，酶最適溫度55～70℃。如嗜熱鏈球菌[1]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[2]等。

研究報(bào)道表明許多棲熱菌（Thermus）也能編碼熱穩(wěn)定性的β-半乳糖苷酶。1972年，Ulrich等[14]首次對(duì)棲熱菌（Thermus sp.T2）來源的耐熱β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，該酶最適作用溫度80℃，最適pH5.0；中性環(huán)境可保持良好的穩(wěn)定性，pH7.0，70℃加熱10min可保持100%酶活。1998年，Vian等[15]將Thermus sp.T2來源的耐熱β-半乳糖苷酶在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，重組酶的耐熱性能保持良好，70℃加熱1h酶活保留率為50%。而Ohtsu等[3]從日本Atagawa溫泉中分離到一種棲熱菌（Thermus sp.A4），其耐熱β-半乳糖苷酶具有極好的熱穩(wěn)定性，可在70℃加熱20h保持酶活不受損失。Dion等[16]從Thermus thermophilus HB27中克隆并表達(dá)了一種耐熱β-半乳糖苷酶，可以催化β-D-半乳糖苷、β-D-葡萄糖苷和β-D-果糖苷衍生物水解；最適溫度88℃，中性條件下，pH7.0，80℃加熱10min可保持100%酶活。

另外，來自Caldicellulosiruptor saccharolyticus，Sterigmatomyceselviae，Thermotoga maritime以 及Thermus aquaticu的耐熱β-半乳糖苷酶的最適作用溫度均可以達(dá)到80℃以上。沃氏火球菌（Pyrococcus woesei）最適作用溫度93℃，最適pH5.4，85℃和93℃加熱4h酶活分別保留89%和85%[17-18]。礦泉古生菌中硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）也能編碼一種極耐熱的β-半乳糖苷酶，最適溫度高于90℃[19-20]。另外，熱產(chǎn)硫磺梭菌（Clostridium thermosulfurogenes EM1）β-半乳糖苷酶，最適pH7.0，在70℃長(zhǎng)時(shí)間加熱酶活仍穩(wěn)定[21]。

表1 不同微生物來源的耐熱-半乳糖苷酶及其酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Thermos table β-galactosidases from different microbial sources and its enzymatic properties

2 耐熱β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)特征及催化機(jī)制

2.1 耐熱β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)特征

水解酶基于氨基酸序列相似性被分類為不同家族，到目前為止，共有115個(gè)糖苷水解酶家族（Glycoside Hydrolase Family）分屬于14個(gè)超家族（Super Family）GH-A-GH-N。其中，GH-A超家族由18個(gè)水解酶家族組成（1，2，5，10，17，26，30，35，39，42，50，51，53，59，72，79，86，113），β-半乳糖苷酶屬于其中GH-1，GH-2，GH-35和GH-42（http：//www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html）。目前已報(bào)道的耐熱β-半乳糖苷酶多屬于糖苷水解酶42家族（GH-42）[22]。該家族所屬乳糖酶很多來源于極性微生物（如嗜熱[23]、嗜冷[4，24]、嗜鹽微生物[25]等），因此該家族的乳糖酶結(jié)構(gòu)具有理論研究代表性。GH-42家族乳糖酶具有典型的TIM（Distored triosephosphate isomerase）barrel特征，即由8個(gè)重復(fù)的β折疊接α螺旋（β/α）8單元構(gòu)成酶的催化結(jié)構(gòu)域[26]。該水解酶家族的催化機(jī)制屬于典型的保持型催化（Retaining glycoside hydrolases），氨基酸序列長(zhǎng)度為600～700aa，分子量均在70～80ku之間。這一家族中每個(gè)成員都具有兩個(gè)保守的谷氨酸作為催化氨基酸。催化中心通常位于TIM barrel的第4和第7個(gè)β片層結(jié)構(gòu)上，因此GH-42基于結(jié)構(gòu)域特征被分類為4/7超家族（4/7 Super Family）[27]。

2.2 耐熱β-半乳糖苷酶的催化機(jī)制

糖苷水解酶有兩種經(jīng)典的催化機(jī)制，即保持型（retaining）機(jī)制和反轉(zhuǎn)型（inverting）機(jī)制，由Koshland在56年前提出并一直沿用至今。這一理論主要基于糖苷水解酶在催化過程中會(huì)出現(xiàn)兩種不同的立體化學(xué)產(chǎn)物，即產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)象與供體底物的相同或不同。水解酶家族的結(jié)構(gòu)特征并不直接決定酶的立體化學(xué)催化活性，很多超家族中都同時(shí)具有保持型和反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶。但分屬同一家族中的酶往往具有相同的催化機(jī)制。其中，耐熱β-半乳糖苷酶所屬的GH-42家族中已報(bào)道的糖苷水解酶均屬保持型。

保持型水解酶遵循兩步反應(yīng)的雙替換機(jī)制（twostep double-displacement mechanism），包括糖苷-酶復(fù)合物過渡態(tài)的形成和水解，每步反應(yīng)均通過酸堿催化完成[28]。這個(gè)過程需要兩個(gè)含羧基的關(guān)鍵氨基酸參與，一個(gè)作為親核基團(tuán)攻擊底物異頭碳形成糖苷-酶復(fù)合物；另一個(gè)羧基基團(tuán)作為酸堿催化劑，在第一步反應(yīng)中使羰基氧質(zhì)子化，第二步反應(yīng)中催化脫去一分子水。在兩個(gè)催化關(guān)鍵殘基之間需達(dá)到一個(gè)較小的距離（0.55nm），以滿足親核攻擊反應(yīng)發(fā)生的條件。

3 耐熱β-半乳糖苷酶的定向進(jìn)化研究

已有的研究表明，GH-42家族β-半乳糖苷酶對(duì)乳糖的水解活性大多很弱或是缺失。究其原因?yàn)?，耐熱?半乳糖苷酶所屬微生物多生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中，如溫泉[3，15，29]、土壤（Bacillus，Streptomyces spp.）及高鹽環(huán)境[25，30]等，據(jù)此推測(cè)進(jìn)化過程中耐熱的β-半乳糖苷酶類利用乳糖并以乳糖作為主要碳源的機(jī)會(huì)很少，因而乳糖不是這類β-半乳糖苷酶的最適作用底物，故多數(shù)耐熱β-半乳糖苷酶表現(xiàn)出水解活性弱的特點(diǎn)[31]。目前針對(duì)耐熱β-半乳糖苷酶功能的改造主要集中在提高其乳糖水解率和低聚半乳糖（galactooligosaccharides）的合成量。這兩個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域分別應(yīng)用到了耐熱β-半乳糖苷酶的水解催化活性和轉(zhuǎn)糖苷活性，二者有著緊密聯(lián)系，糖苷鍵在乳糖酶的催化作用下斷裂后，當(dāng)糖苷受體為水分子時(shí)催化結(jié)果即表現(xiàn)為糖苷鍵的水解；與之對(duì)應(yīng)，當(dāng)糖苷受體為另一糖分子時(shí)則表現(xiàn)為糖苷的轉(zhuǎn)移。2010年Yeong-Su Kim等[32]從降低水解產(chǎn)物對(duì)乳糖酶抑制作用角度對(duì)C. saccharolyticus來源的耐熱β-半乳糖苷酶進(jìn)行改造，通過預(yù)測(cè)乳糖酶抑制劑半乳糖與酶的結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)這些位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行丙氨酸替換。研究發(fā)現(xiàn)Phe-349位點(diǎn)是影響半乳糖對(duì)酶抑制作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，并針對(duì)F349進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到的F349S突變體酶在含有半乳糖抑制劑反應(yīng)體系中乳糖水解率高達(dá)99%。2009年，德國(guó)學(xué)者Placier等[33]采用隨機(jī)突變的方法對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行改造，篩選得到轉(zhuǎn)糖苷活性提高的突變體R109K。通過對(duì)Arg-109位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，成功獲得低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide）合成能力提高的突變體R109W。

4 展望

耐熱β-半乳糖苷酶與常溫及低溫乳糖酶類相比，其在乳品生產(chǎn)工藝中有著顯著的優(yōu)勢(shì)。大多數(shù)的耐熱β-半乳糖苷酶的最適作用溫度在60℃以上，高溫下熱穩(wěn)定性良好，能夠有效降低生產(chǎn)工藝中微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，耐熱β-半乳糖苷酶具有較高的抗化學(xué)變性作用，在室溫下有較長(zhǎng)的貯存期。另外，較高的作用溫度使耐熱β-半乳糖苷酶的催化反應(yīng)具有較高的初始反應(yīng)速率和底物溶解濃度，可以提高反應(yīng)速度，降低反應(yīng)體系粘度及水解產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的抑制作用，有利于提高生產(chǎn)效率。因而，耐熱β-半乳糖苷酶多表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)糖苷活性。其中來自于Alicyclobacillus acidocaldarius的耐熱β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性最高可達(dá)592U/mg[34]。圍繞耐熱β-半乳糖苷酶高溫下生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)的研究報(bào)道很多，但將其應(yīng)用到生產(chǎn)的研究還不是很多，僅有個(gè)別重組表達(dá)的耐熱β-半乳糖苷酶用于低聚乳糖生產(chǎn)的研究報(bào)道，包括Geobacillus stearothermophilus[33]、Pyrococcus furiosus[35]以及Thermus sp.[36]來源的耐熱β-半乳糖苷酶。雖然耐熱β-半乳糖苷酶在生產(chǎn)及貯存方面的優(yōu)點(diǎn)越來越引起人們的關(guān)注，但由于熱穩(wěn)定性的酶大都來源于嗜熱微生物，這些微生物往往難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，或需要高溫發(fā)酵設(shè)備。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建能高效表達(dá)耐熱酶的常溫重組工程菌，可有效解決這一難題。因?yàn)槌刂亟M工程菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的宿主蛋白絕大多數(shù)對(duì)熱不穩(wěn)定，只要將工程菌的發(fā)酵液進(jìn)行熱處理就可方便地純化異源耐熱酶蛋白，易于大規(guī)模生產(chǎn)及純化。但未來還需要在耐熱β-半乳糖苷酶高效表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建領(lǐng)域進(jìn)行不斷的探索，這也將是實(shí)現(xiàn)耐熱β-半乳糖苷酶應(yīng)用價(jià)值的一項(xiàng)重要課題。

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Research progress in thermostable β-galactosidases

DONG Yi-ning,CHEN Hai-qin,LIU Xiao-ming,ZHANG Hao,CHEN Wei*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Thermostable β-galactosidases have become commercially important in the field of diary industry, owing to their high catalytic temperature and stability.Because of their significant value in theoretical research and application,thermostable β-galactosidases have

a great deal of attention.In this review,the research progress on thermostable β-galactosidases were discussed,including the sources of microorganism, characteristics,structural properties,catalytic mechanism and directed evolution of thermostable β-galactosidases. The industrial needs for thermostable-galactosidases and improvements required to their application in the future were also suggested.

thermostable β-galactosidase；structure properties；catalytic mechanism；directed evolution

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0384-04

2011－01－10 *通訊聯(lián)系人

董藝凝（1980-），女，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（JUSRP11017，JUSRP31002）。