陳 文,張 靜,常 平,任 超,張艷貞
(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100191)
玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)與抗氧化能力的影響
陳 文,張 靜,常 平,任 超,張艷貞
(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100191)
探討玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)與抗氧化能力的影響。將8周齡雄性BALB/C小鼠分為4組:正常對(duì)照組(C組)、應(yīng)激對(duì)照組(S組)、低劑量玫瑰花茶組(L-RE組)、高劑量玫瑰花茶組(H-RE組)。S、L-RE、H-RE組小鼠每天給予1h的束縛刺激,30min后分別灌喂水和相應(yīng)劑量的玫瑰花茶。連續(xù)灌胃6周后用BIOSEB小鼠懸尾自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行尾懸掛實(shí)驗(yàn),并分析血漿同型半胱氨酸(HCY)、肝臟還原型谷胱苷肽(GSH)含量和過氧化氫酶(CAT)活性。結(jié)果顯示,與C組相比較,S組小鼠懸尾時(shí)后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間延長了93%、活動(dòng)消耗的量能和活動(dòng)能力都下降,肝臟CAT活性、GSH含量都明顯降低(P<0.05),血漿HCY含量顯著升高(P<0.05)。與S組相比較,L-RE組小鼠的不動(dòng)時(shí)間降低了53%,活動(dòng)消耗的量能、活動(dòng)能力分別提高了87%、47%,L-RE組和H-RE組小鼠肝臟CAT活性、GSH含量都明顯增加(P<0.05),血漿HCY含量分別降低了20%和14%。提示玫瑰花茶提高了小鼠的抗氧化能力,改善了束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的高HCY血癥,增強(qiáng)了尾懸掛實(shí)驗(yàn)中小鼠的掙扎活動(dòng)能力,縮短了不動(dòng)時(shí)間,在一定程度上緩解了束縛應(yīng)激小鼠的“行為絕望”狀態(tài)。
玫瑰花,尾懸掛實(shí)驗(yàn),抗氧化,束縛應(yīng)激,小鼠
應(yīng)激是指機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng),長期過度的應(yīng)激會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[1-3]。應(yīng)激又與焦慮和抑郁密切相關(guān),被認(rèn)為是導(dǎo)致焦慮和抑郁的誘因。本文從尾懸掛實(shí)驗(yàn)和抗氧化能力等不同方面來觀測(cè)玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠的影響,以初步探討玫瑰花茶“緩解壓力”之功效。
高氯酸 北京南尚樂化工廠,分析純;硼砂 北京益利精細(xì)化學(xué)有限公司,分析純;氫氧化鈉 北京化學(xué)試劑廠,分析純;醋酸鈉 中國醫(yī)藥公司,分析純;甲醇 CALEDON公司,色譜純;二硫蘇糖醇(DTT,純度≥99%)、7-氟苯-2-氧-1,3-重氮-4-磺胺(SBD-F,純度≥98.5%)、同型半胱氨酸(HCY,純度≥95%) Fluak公司;過氧化氫酶試劑盒、還原型谷胱甘肽試劑盒 南京建成生物工程研究所;玫瑰花 康美藥業(yè)股份有限公司。
小鼠懸尾自動(dòng)分析系統(tǒng) 法國BIOSEB公司;高效液相色譜儀 600E,配有熒光檢測(cè)器,美國Waters公司;BR4高速離心機(jī) 法國Jouan公司;WFZ UV-2000紫外可見分光光度計(jì) 美國UNICO公司。
1.2.1 玫瑰花茶的制備 稱取玫瑰花9、4.5g,分別浸于100mL沸水中,超聲提取30min,過濾,濾液分別作為高劑量玫瑰花茶(9g/100mL)和低劑量玫瑰花茶(4.5g/100mL)。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡雄性BALB/C小鼠60只(SPF級(jí),購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),在光-暗周期為12h、溫度20~22℃的環(huán)境下適應(yīng)飼養(yǎng)一周后,按體重隨機(jī)分成四組:正常對(duì)照組(C組)、應(yīng)激對(duì)照組(S組)、低劑量玫瑰花茶組(L-RE組)、高劑量玫瑰花茶組(H-RE組)。各組小鼠均自由攝食飲水,S組、L-RE組、H-RE組小鼠每天置于帶有透氣孔的束縛管中,給予1h的束縛刺激,30min后分別灌喂0.4mL水、低劑量玫瑰花茶、高劑量玫瑰花茶。連續(xù)喂飼6周,于第6周末期進(jìn)行尾懸掛實(shí)驗(yàn)。次日,各組小鼠灌胃后30min,采血,測(cè)定血漿同型半胱氨酸(HCY)含量;采血后處死小鼠,取肝臟測(cè)定還原型谷胱苷肽(GSH)含量和過氧化氫酶(CAT)活性。
1.2.3 尾懸掛實(shí)驗(yàn) 將小鼠尾端0.5cm處環(huán)繞粘貼上小膠條,膠條鉤在懸尾儀上,使動(dòng)物呈倒掛狀態(tài),頭部離臺(tái)面約5cm,懸掛6min,記錄小鼠后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。結(jié)束后用75%酒精擦拭懸尾儀箱體并揮干,再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。
1.2.4 小鼠肝臟GSH含量、CAT活性的測(cè)定 取一定量肝臟,用生理鹽水制成5%勻漿液。取部分勻漿液3000r/min離心10min,取上清液,按照試劑盒方法測(cè)定小鼠肝臟GSH含量。另取部分勻漿液,稀釋5倍后,3000r/min離心10min,取上清液,按照試劑盒方法測(cè)定小鼠肝臟CAT活性。
1.2.5 小鼠血漿同型半胱氨酸含量的分析 參照黃其擎[4]等的HPLC方法,流動(dòng)相0.08mol/L醋酸鈉含1%甲醇,Waters Symmetry Shield TM RP18色譜柱(3.9mm× 150mm,5μm),流速0.8mL/min,進(jìn)樣量20μL,激發(fā)波長390nm,發(fā)射波長470nm。
實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組小鼠間體重?zé)o差異,經(jīng)過6周的實(shí)驗(yàn)后,與C組相比較,S組的體重有所降低(P<0.05),提示束縛刺激使小鼠產(chǎn)生焦慮情緒,影響了體重增長;與S組相比較,L-RE組和H-RE組小鼠體重也明顯減輕(P<0.05),提示玫瑰花茶有一定減重效果。
表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體重的變化(±s,n=13)Table 1 The change of mice body weight(±s,n=13)
表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體重的變化(±s,n=13)Table 1 The change of mice body weight(±s,n=13)
注:*:與實(shí)驗(yàn)前C組比較有顯著性差異(P<0.05);#:與實(shí)驗(yàn)后C組比較有顯著性差異(P<0.05);##:與實(shí)驗(yàn)后S組比較有顯著性差異(P<0.05)。
組別 實(shí)驗(yàn)前體重(g) 實(shí)驗(yàn)后體重(g)C組 23.2±1.0 27.0±1.8* S組 23.4±0.9 25.6±1.2# L-RE組 23.1±0.9 24.1±1.6## H-RE組 23.2±1.3 23.7±1.7##
尾懸掛實(shí)驗(yàn)中,小鼠為克服不正常的倒掛體位而掙扎活動(dòng),企圖逃脫。但活動(dòng)一定時(shí)間后,出現(xiàn)間斷性“不動(dòng)”顯示“失望”、“行為絕望”狀態(tài)。懸掛6min,計(jì)算后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。同時(shí)法國BIOSEB小鼠懸尾自動(dòng)分析系統(tǒng)還能給出活動(dòng)消耗的量能和活動(dòng)能力等數(shù)據(jù),以綜合判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,連續(xù)喂飼6周后,與C組相比較,S組小鼠后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間延長了93%,活動(dòng)消耗的量能和活動(dòng)能力分別下降了42%和26%,提示每天的束縛刺激使小鼠產(chǎn)生放棄逃脫的傾向;與S組相比較,L-RE組小鼠的不動(dòng)時(shí)間降低了53%,活動(dòng)消耗的量能、活動(dòng)能力分別提高了87%、47%,提示低劑量玫瑰花茶在一定程度上增強(qiáng)了束縛應(yīng)激小鼠的掙扎活動(dòng)能力,縮短了不動(dòng)時(shí)間,緩解了小鼠的“失望”狀態(tài)。
表2 玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)的影響(±s,n=13)Table 2 The effect of rose extract on tail suspension test in stressed mice(±s,n=13)
表2 玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)的影響(±s,n=13)Table 2 The effect of rose extract on tail suspension test in stressed mice(±s,n=13)
注:*:與S組比較有顯著性差異(P<0.1);#:與C組比較有顯著性差異(P<0.1)。
組別 懸尾時(shí)后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間(s) 活動(dòng)消耗的量能 活動(dòng)能力C組 14.7±11.2 8858±2292 37.1±10.0 S組 28.5±25.6 5116±2501* 27.4±13.5* L-RE組 13.5±9.7# 9590±4885# 40.3±20.1# H-RE組 15.0±14.4 7716±3594 31.7±15.1
表3 玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠抗氧化能力的影響(±s,n=13)Table 3 The effect of rose extract on antioxidant capacity of stressed mice(±s,n=13)
表3 玫瑰花茶對(duì)束縛應(yīng)激小鼠抗氧化能力的影響(±s,n=13)Table 3 The effect of rose extract on antioxidant capacity of stressed mice(±s,n=13)
注:*:與C組比較有顯著性差異(P<0.05);#:與S組比較有顯著性差異(P<0.05)。
血清HCY含量(μg/100mL)C組 16.6±3.2 4.77±0.28 34.5±3.9 S組 13.5±2.8* 4.16±0.54* 46.1±11.0* L-MG組 16.9±3.1# 5.16±0.49# 36.0±6.4# H-MG組 17.1±3.7# 5.23±0.72# 38.8±10.8組別 肝臟CAT活性(U/mg·prot)肝臟GSH含量(mg/g·prot)
由表3可見,與C組相比較,S組小鼠肝臟CAT活性、GSH含量都明顯降低(P<0.05),血漿HCY含量顯著升高(P<0.05),提示每天的束縛刺激使小鼠抗氧化能力下降;與S組相比較,L-RE組和H-RE組小鼠肝臟CAT活性、GSH含量都明顯提高(P<0.05),血漿HCY含量分別降低了20%和14%,提示玫瑰花茶能夠改善束縛應(yīng)激小鼠的抗氧化能力。
應(yīng)激易引起機(jī)體的氧化損傷,對(duì)多種疾病如心腦血管疾病、惡性腫瘤和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展都有重要影響[1]。因此,研究應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響具有重要意義。
2001年,吳淑慶[2-3]等人報(bào)道束縛應(yīng)激能誘導(dǎo)大鼠高同型半胱氨酸血癥,通過對(duì)同型半胱氨酸(HCY)轉(zhuǎn)硫代謝酶胱硫醚β合成酶轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)性調(diào)控影響其活性,最終導(dǎo)致高HCY血癥的發(fā)生。而HCY可通過氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、參與免疫反應(yīng)等多種機(jī)制損傷心臟、血管及血細(xì)胞,導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生,是心腦血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明[5-6],HCY對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性作用可被過氧化氫酶(CAT)所抑制,而在高HCY血癥大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn),血小板聚集性和組織因子活性增強(qiáng)的同時(shí),血液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平也升高,可能與其抑制谷胱甘肽(GSH)的合成、降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶濃度有關(guān)。2004年,Oliveria[7]等人在束縛、游泳、寒冷及適應(yīng)新環(huán)境四種不同條件下檢測(cè)了大鼠血漿HCY水平,發(fā)現(xiàn)只有束縛應(yīng)激顯著提高了大鼠血漿HCY水平。束縛主要可引起動(dòng)物緊張和恐懼的心理反應(yīng),提示心理應(yīng)激可能是引起血漿HCY水平升高的重要因素之一。
應(yīng)激又與焦慮和抑郁密切相關(guān),被認(rèn)為是導(dǎo)致焦慮和抑郁的原因。在焦慮和抑郁生物學(xué)機(jī)制的研究方面,通常利用動(dòng)物對(duì)應(yīng)激性或新異性事件的行為或生理反應(yīng)來觀測(cè)動(dòng)物的焦慮或抑郁狀態(tài),尾懸掛實(shí)驗(yàn)就是方法之一[8]。尾懸掛實(shí)驗(yàn)中,小鼠為克服不正常的倒掛體位而掙扎活動(dòng),企圖逃脫。但活動(dòng)一定時(shí)間后,出現(xiàn)間斷性“不動(dòng)”顯示“失望”、“行為絕望”狀態(tài)。間斷不動(dòng)時(shí)間也能一定程度地反映動(dòng)物的肌力。
本實(shí)驗(yàn)中,束縛應(yīng)激組小鼠懸尾時(shí)后4min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間延長了93%,活動(dòng)消耗的量能和活動(dòng)能力都下降,提示每日的束縛刺激使小鼠產(chǎn)生放棄逃脫的傾向;同時(shí),小鼠肝臟CAT活性、GSH含量都明顯降低(P<0.05),而血漿HCY含量顯著升高(P<0.05),提示束縛刺激誘導(dǎo)了高HCY血癥,使小鼠抗氧化能力下降。束縛主要通過使動(dòng)物的軀體活動(dòng)受限,而使小鼠產(chǎn)生掙扎、急躁、憤怒、抑郁、絕望等心理及行為變化。較長的造模周期與每天造模時(shí)間的不固定,可增強(qiáng)上述心理應(yīng)激效果。本實(shí)驗(yàn)中,由于反復(fù)、長期的束縛,產(chǎn)生慢性應(yīng)激,引起機(jī)體的功能紊亂,從而導(dǎo)致軀體及精神疲勞的發(fā)生。
玫瑰花作為藥食兩用的物品,含有多種生物活性成分,主要包括揮發(fā)油、鞣質(zhì)、氨基酸、黃酮類、色素類、多酚類等等[9-11],其主要的功效報(bào)道集中在抗氧化、抗菌抗病毒、以及對(duì)心血管的保護(hù)等方面。曾佑煒[12]等人曾報(bào)道玫瑰花水提液具有良好的清除二苯代苦味酰自由基(DPPH)的作用。本實(shí)驗(yàn)中,在連續(xù)給予小鼠束縛應(yīng)激6周后,與應(yīng)激對(duì)照組相比較,低劑量玫瑰花茶組小鼠的不動(dòng)時(shí)間降低了53%,活動(dòng)消耗的量能、活動(dòng)能力分別提高了87%、47%,兩個(gè)劑量玫瑰花茶組小鼠肝臟CAT活性、GSH含量都明顯提高(P<0.05),血漿HCY含量分別降低了20%和14%。以上結(jié)果提示低劑量玫瑰花茶通過提高小鼠的抗氧化能力,改善了束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的高HCY血癥,在一定程度上增強(qiáng)了尾懸掛實(shí)驗(yàn)中束縛應(yīng)激小鼠的掙扎活動(dòng)能力,縮短了不動(dòng)時(shí)間,緩解了小鼠的“失望”、“行為絕望”狀態(tài)。
本實(shí)驗(yàn)中束縛刺激抑制了小鼠體重的增長。而與應(yīng)激對(duì)照組相比較,兩個(gè)玫瑰花茶組小鼠的體重也都減輕,這與我們此前關(guān)于玫瑰花茶功效作用的研究結(jié)果(未發(fā)表)相吻合,玫瑰花茶組均多次出現(xiàn)減重效果。關(guān)于玫瑰花茶減重減壓功效及其作用機(jī)制有待于深入探討。
本文初步證實(shí)玫瑰花茶提高了小鼠的抗氧化能力,改善了束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的高HCY血癥,增強(qiáng)了尾懸掛實(shí)驗(yàn)中小鼠的掙扎活動(dòng)能力,縮短了不動(dòng)時(shí)間,在一定程度上緩解了束縛應(yīng)激小鼠的“行為絕望”狀態(tài),為玫瑰花茶“緩解壓力”功效研究提供了一些參考依據(jù)。
[1]程義勇.醫(yī)藥衛(wèi)生技術(shù)進(jìn)展[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1997:14-19.
[2]吳淑慶,錢令嘉.應(yīng)激大鼠血漿同型半胱氨酸水平的變化及其對(duì)心功能的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2001,13(3):137-139.
[3]吳淑慶,錢令嘉.應(yīng)激對(duì)同型半胱氨酸代謝的負(fù)性調(diào)節(jié)[J].生理學(xué)報(bào),2004,56(4):521.
[4]Huang QQ,Hui RT,Zhang CL.Application of HPLC for determination of homocysteine level in plasma[J].Int J Med,1999(3):50-52.
[5]Durand P,Lussier-Cacan S,Blache D.Acute methionine loadinduced hyperhomocysteinemia enhances platelet aggregation,thromboxane biosynthesis,and macrophage-derived tissue factor activity in rats[J].FASEBJ,1997,11(13):1157-1168.
[6]Lentz SR.Homocysteine and vascular disfunction[J].Life Science,1997,61(13):1205-1215.
[7]Oliveria AC,Suchecki D,et al.Acute stressor-selective effect on total plasma homocysteine concentration in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2004,77:269-273.
[8]亓?xí)喳悾治木?焦慮和抑郁動(dòng)物模型的研究方法和策略[J].心理科學(xué)進(jìn)展,2005,13(3):327-332.
[9]劉梅,劉奎紡.新疆玫瑰精油化學(xué)成分的研究[J].精細(xì)化工,2002,19(7):388-389.
[10]謝瓊,張益娜,李敏,等.紫外分光光度法測(cè)定玫瑰花和玫瑰花渣中的總黃酮含量[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2007,97(4):19-20.
[11]尉芹,王永紅,胡亞云,等.玫瑰花渣化學(xué)成分與營養(yǎng)成分研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,20(3):140-141.
[12]曾佑煒,趙金鏈,彭永宏.玫瑰花抗氧化活性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(3):205-209.
Effect of rose extract on tail suspension test and antioxidant capacity in stressed mice
CHEN Wen,ZHANG Jing,CHANG Ping,REN Chao,ZHANG Yan-zhen
(College of Artsamp;Science of Beijing Union University,Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods,Beijing 100191,China)
In order to study the effect of rose extract on tail suspension test and antioxidant capacity of stressed mice,8-weeks-old male BALB/C mice were divided into 4 groups:control group(C),stressed group(S),lowdose rose extract group(L-RE)and high-dose rose extract group(H-RE)based on their body weights.The mice of S,L-RE and H-RE group were suffered restraint stress 1h per day.6 weeks later,tail suspension test was done,and plasma homocysteine(HCY)and liver reduced glutathione(GSH)and catalase activity were determined.Results:Compared with C group,immobility duration of S group in tail suspension test prolonged by 93%,total spent energy and the power of movement declined,liver GSH and CAT activity significantly decreased(P<0.05),and plasma HCY remarkably increased(P<0.05).Compared with S group,immobility duration of L-RE group in tail suspension test shortened by 53%,total spent energy and the power of movement improved 87%and 47%respectively,both of liver GSH and CAT activity significantly increased(P<0.05)in L-RE and H-RE group,and plasma HCY reduced.The above results suggested that rose extract improved the antioxidant capacity of stressed mice,reduced plasma HCY level,shortened the duration of immobility and enhanced the power of movement in tail suspension test.
rose;tail suspension test;antioxidant capacity;restraint stress;mice
TS201.4
A
1002-0306(2012)01-0376-03
2011-09-09
陳文(1966-),女,博士,副教授,研究方向:營養(yǎng)與功能食品。
北京聯(lián)合大學(xué)自然科學(xué)類項(xiàng)目(2009)。