王桂珍,凌輝生,謝麗思,李任強
(暨南大學生物工程學系,廣東廣州510632)
親和層析快速提取白果和大豆的抗氧化蛋白
王桂珍,凌輝生,謝麗思,李任強*
(暨南大學生物工程學系,廣東廣州510632)
用環(huán)氧氯丙烷活化法把血紅素結合于惰性分子篩填料Sephadex G-25上作為配基做成親和層析柱,用于從白果或大豆中提取具有抗氧化活性的蛋白。此層析柱以去離子水為平衡液、0.2mol/L的NaAc-HAc緩沖液(pH3.6)為洗脫液,層析得到的蛋白經亞油酸-硫氰酸鉀抗氧化活性測定證明具有較高的抗氧化活性。白果全蛋白的抗氧化活性為7.92%,經此方法提純后得到2種抗氧化多肽,活性達到17.45%;而大豆中的抗氧化蛋白經純化則得到多種,抗氧化活性由全蛋白時的10.52%提高至30.72%。這是一個新的、只需一個步驟即可從白果或大豆蛋白提取液中提取到具有高抗氧化活性蛋白的方法,具有成本低,快速高效的特點。
血紅素,親和層析,白果,大豆,抗氧化蛋白
外源性抗氧化劑可以幫助清除人體內過量的自由基,維持身體健康。許多天然食物具有抗氧化性,因為它們含有大量的抗氧化物質。植物性食品中的許多具有抗氧化活性的物質屬于蛋白質類,它們對于抑制膜脂質過氧化、清除生物體內過量自由基等具有重要意義。白果清蛋白具有抗輻射損傷,恢復小鼠免疫機能等功效,對超氧陰離子自由基的清除率達50%左右,對羥基自由基的清除率在80%以上[1-2]。大豆蛋白可有效抵御機體的脂質過氧化,降低甲狀腺和腦組織受自由基損傷的程度[3]。魔芋多肽對紅細胞氧化溶血的抑制作用強于茶多酚[4]。許多研究說明,包括菜籽蛋白[5]、大豆蛋白[6]、白果蛋白[7]等,都具有抗氧化活性,所以,如何提取純化它們成為了研究的一個重要內容。雖然從食物中提取抗氧化蛋白可采取不同的方法[8-13],但這些方法一般或較繁雜或效率不高。本研究的目的就是探討能簡單快速且有效的提取白果、大豆中的抗氧化蛋白的方法。血紅素由卟啉環(huán)在中心結合一個鐵原子構成,也稱為鐵卟啉[14],是一個性質極其活潑的輔酶,能與很多蛋白結合。血紅素的鐵有第五和第六配位鍵,能與物質通過電子轉移(氧化還原)發(fā)生反應從而結合。抗氧化活性蛋白起作用時一般就是通過電子轉移而實現(xiàn),所以,如果把血紅素固定在載體上,利用鐵原子的第五、第六配位鍵的高活性,就有可能捕獲抗氧化蛋白?;诖?,本研究選用血紅素作為配基做成親和層析柱用于提取抗氧化蛋白。
白果、大豆 從市場購買;Sephadex G-25惰性填料 廣州奇華盛生物技術有限公司;氯化血紅素Sigma公司;亞油酸、低相對分子質量蛋白質標記物、硫氰酸鉀、EDTA等 廣州斯佳生物科技有限公司,分析純;其他用于活化惰性填料、固定血紅素或做電泳等的試劑 均為分析純。
層析柱 Milipore;核酸蛋白檢測儀HD-2001-B-C型 上海嘉鵬;生物電泳圖像分析系統(tǒng)FR-980型 上海復日科技;真空冷凍干燥器 Heto;低溫高速離心機 Thermo Election Corporation;電泳系統(tǒng)配有Power Pac HV電泳儀和Mini-Protean 3電泳槽 Bio-Rad公司;紫外-可見分光光度計Gold Spectrcum54上海凌光。
1.2.1 親和層析柱的制備 Sephadex G-25惰性載體的活化:25g Sephadex G-25經充分浸泡后置于燒結漏斗,以1mol/L NaCl和去離子水分別洗滌數(shù)次,移至小燒瓶中,加入19mL 2mol/L NaOH、5mL環(huán)氧氯丙烷和25mL 56%1,4-二氧六環(huán),于40℃恒溫搖床中震蕩充分活化2h后置于燒結漏斗中去掉活化液,用去離子水和0.1mol/L,pH9.5的Na2CO3-NaHCO3緩沖液洗滌后用于與配基血紅素的偶聯(lián)。
氯化血紅素與Sephadex G-25載體偶聯(lián):氯化血紅素先用少量15%的氨水溶解,然后加入去離子水至終濃度為2mmol/L,取29mL與已活化的載體混合。在40℃恒溫搖床中慢速振蕩偶聯(lián)24h,置于燒結漏斗用去離子水洗掉未反應的試劑。把已偶聯(lián)上血紅素的Sephadex G-25裝柱,得到一黑褐色的以血紅素為配基的層析柱(柱體積為11cm×1.5cm)。
1.2.2 蛋白粗提液的準備 稱取120g白果,脫皮洗凈,加入冷的磷酸緩沖液(0.01mol/L,pH7.2),用勻漿機勻漿。勻漿在室溫下緩慢攪拌30min后靜置在4℃中浸提過夜,離心(4℃,10000r/min,30min)收集上清(重復離心三次以除去上清黃色浮油塊狀物)。上清液中加入硫酸銨至80%飽和度,4℃靜置過夜;離心收集黃色沉淀,用少量磷酸緩沖液溶解,以去離子水透析除鹽;透析后的溶液離心去沉淀即得蛋白粗提液。
稱取100g大豆,水浸泡6h后用勻漿機勻漿。勻漿在室溫下緩慢攪拌30min后靜置在4℃中浸提過夜,離心(4℃,10000r/min,30min),收集上清(重復離心三次以除去上清乳黃色浮油塊狀物)。上清液中加入硫酸銨至80%飽和度,4℃靜置過夜;離心收集黃色沉淀,用少量水溶解,以去離子水透析除鹽;透析后的溶液離心去沉淀即得蛋白粗提液。
1.2.3 親和層析操作 分別以NaAc-HAc緩沖液(0.2mol/L,pH3.6)、去離子水和Na2CO3-NaHCO3緩沖液(0.1mol/L,pH9.5)洗滌血紅素層析柱,最后用去離子水平衡。10mL蛋白粗提液上柱,流速為0.2mL/min。上樣完畢后,繼續(xù)用去離子水洗脫,收集OD280出現(xiàn)峰值的洗脫液即未被柱子吸附的蛋白質(穿透峰),待OD280降至基線,換用0.2mol/L,pH3.6的NaAc-HAc緩沖液進行洗脫,收集出現(xiàn)峰值的洗脫液即被柱子吸附而后洗脫的蛋白質。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定 經過透析除鹽后,穿透峰液及洗脫蛋白液(經一定程度濃縮)各取0.05mL,分別加入等體積的蛋白樣品溶解液混合,沸水浴處理2min后作為電泳樣品。電泳所用的分離膠質量分數(shù)為13%,濃縮膠質量分數(shù)為4%。電泳結束后,經染色、脫色后,采用電泳分析系統(tǒng)獲取圖像進行分析。
1.2.5 血紅素與蛋白的反應及其光譜分析 為了測定被血紅素層析柱吸附的那部分蛋白是否真正能與血紅素起反應,將這部分蛋白直接與血紅素混合后,通過光譜分析來判斷它們之間的關系。以考馬斯亮藍法[15]測定各蛋白樣品的濃度。取已知濃度的蛋白100μL加入Tris緩沖液(0.05mol/L,pH8.0)稀釋一定倍數(shù),再加入10μL 2mmol/L的血紅素在37℃下反應5min,用分光光度計進行掃描分析。
1.2.6 亞油酸-硫氰酸鉀方法測定蛋白抗氧化活性
1.2.6.1 亞油酸過氧化反應 測定方法主要按參考文獻[16]進行。在5mL具塞管加入1.5mL 0.15mol/L(pH7.0)的磷酸緩沖液,加入待測蛋白樣品100μL,加入100μL 50mmol/L亞油酸的乙醇溶液和25μL 50mmol/L的FeCl2-EDTA溶液,采用漩渦分散器振蕩后,蓋上蓋,于50℃暗處水浴保溫4h。
1.2.6.2 蛋白樣品抗氧化活性檢測 另取具塞管,加入3mL 75%乙醇,上述亞油酸過氧化已反應4h的混合液100μL,100μL含1mol/L FeCl2的1.0mol/L HCl溶液,100μL 30%KSCN,采用漩渦分散器振蕩3min后用蒸餾水調零,在480nm處測定溶液的吸光度AS。以水取代蛋白進行同樣操作作為對照,測出抗氧化劑空白的吸光度A0。
測定重復多次,取平均值。蛋白抗氧化活力AA可由以下公式求出:
圖1 白果蛋白粗提液在血紅素-Sephadex G-25親和層析柱上的洗脫峰Fig.1 Elution peak of ginkgo protein crude extract in hemin-Sephadex G-25 affinity chromatography column
圖1、圖2分別為白果與大豆蛋白粗提液經層析柱后的分離效果。不管是白果,還是大豆,大部分蛋白都不被血紅素吸附而成為穿透峰(大峰),只有很少一部分的蛋白被吸附到親和柱上,這部分蛋白為洗脫峰(小峰),可認為是與血紅素有相互作用的蛋白。
圖2 大豆蛋白粗提液在血紅素-Sephadex G-25親和層析柱上的洗脫峰Fig.2 Elution peak of soybean protein crude extract in hemin-Sephadex G-25 affinity chromatography column
對各蛋白樣品進行SDS-PAGE分析的結果如圖3。白果和大豆蛋白中,大部分蛋白都不被血紅素吸附,但被血紅素吸附的蛋白也不只一種。在白果蛋白中,起碼有二種以上的多肽能與血紅素反應,而在大豆蛋白中,能被血紅素吸附的蛋白種類則甚多。這說明血紅素親和層析能選擇性地與相關蛋白作用。
圖3 親和層析各蛋白樣品SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of different protein samples with affinity chromatography
圖4 白果和大豆的層析柱洗脫蛋白與血紅素混合后的光吸收圖譜Fig.4 Light absorption spectrum of ginkgo and soybean column chromatography eluting protein mixed with hemin
白果和大豆的親和層析洗脫蛋白適當稀釋后分別與血紅素結合后在240~540nm波長范圍的光吸收掃描結果如圖4。不管是白果還是大豆,帶蛋白峰(280nm)的血紅素光譜(蛋白與血紅素混合)與單純血紅素光譜比較,吸收峰出現(xiàn)了向長波長移動的現(xiàn)象,說明白果或大豆的洗脫蛋白與血紅素相互作用發(fā)生了結合,是由于血紅素作為配基而分離出來的蛋白。
將已知濃度的蛋白分別進行不同倍數(shù)的稀釋,使所有蛋白質終濃度為1.924mg/mL。對相同濃度的各蛋白樣品的抗氧化活性測定的結果列于表1。
表1 不同蛋白樣品的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of different protein samples
從表1可看出,白果全蛋白具有一定的抗氧化活性,這些蛋白經過血紅素親和層析柱后,具抗氧化活性的蛋白被柱子吸附,未吸附蛋白失去了抗氧化活性,而由于具抗氧化活性蛋白的提純,洗脫蛋白的抗氧化活性提高了2倍多。對于大豆,情況與白果相似,洗脫蛋白的抗氧化活性比全蛋白的活性提高了將近3倍。其穿透蛋白還保留了一些抗氧化活性,可能與進行親和層析操作時,上樣樣品中蛋白含量較高(大豆蛋白含量相當高)有關。高含量蛋白可致使一小部分具抗氧化活性蛋白由于柱子親和反應已飽和而不被吸附。
以上這些結果充分說明血紅素親和層析柱具有非常優(yōu)良的吸附抗氧化蛋白的特性,能很好地選擇性分離抗氧化蛋白。所以說,利用血紅素親和層析柱能快速、高效率地分離純化抗氧化蛋白。血紅素作為配基能吸附抗氧化蛋白可能與血紅素的活潑性質和抗氧化蛋白的分子結構特性有關。蛋白的抗氧化性多與它們分子中巰基(-SH)含量以及氨基酸殘基的組成有關[17],它們起作用時一般發(fā)生電子的轉移。而血紅素正是以鐵的電子轉移表現(xiàn)其活潑性,所以能與抗氧化蛋白發(fā)生一定反應從而與之結合。
從白果中得到的抗氧化多肽至少有兩種,大豆中的抗氧化蛋白則種類較多。這些結果可能與大豆是高等植物而白果是低等植物有關,高等植物中抗氧化蛋白的種類要多些是符合植物進化的規(guī)律的。圖1、圖2和圖3中都表明被親和層析吸附的蛋白只是一小部分,測定結果則說明這小部分蛋白具有高抗氧化活性,這說明血紅素作為配基能選擇性地吸附具抗氧化活性的蛋白。然而,由于血紅素的活潑性,可能一些非抗氧化但性質相當活潑的蛋白也可能與血紅素結合而混在抗氧化蛋白中,但由抗氧化活性的測定結果可以看出,被分離的蛋白主要還是抗氧化蛋白,因為它們的抗氧化活性相當高。由圖3還可初步判斷,大豆和白果中有相似分子質量(20.1ku)的血紅素結合蛋白或亞基,它們或在分子結構、功能上或在進化上有某些聯(lián)系。深入研究比較它們可能對了解抗氧化蛋白的結構特點及其作用機理會有極大意義。
把血紅素結合于惰性分子篩填料Sephadex G-25上作為配基做成的親和層析柱能選擇性的從白果或大豆蛋白中吸附具抗氧化活性的蛋白,只經一個步驟就可達到快速有效提取食品中的抗氧化蛋白的目的。白果全蛋白的抗氧化活性為7.92%,經本方法提純后得到起碼2種多肽,抗氧化活性達到17.45%;而大豆中的抗氧化蛋白經純化則得到多種,抗氧化活性由全蛋白時的10.52%提高至30.72%。實驗結果說明,以血紅素親和層析法提取食品中的抗氧化蛋白具有成本低,快速高效的特點,適合放大和應用。
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Fast preparation of antioxidant proteins from ginkgo and soybean by using affinity chromatography
WANG Gui-zhen,LING Hui-sheng,XIE Li-si,LI Ren-qiang*
(Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)
After Sephadex G-25 polymerbeads were activated by using epichlorohydrin,hemin was bound with them to prepare an immobilized hemin affinity chromatography column,which was used to prepare antioxidant proteins from ginkgo and soybean.Equilibrated with deionized water and eluted with pH3.6,0.2mol/L NaAc-HAc buffer,those proteins obtained from this column were demonstrated to possess high antioxidative activity(AA)after the measurement with linoleic acid-potassium thiocyanate.AA of crude proteins of ginkgo was 7.92%and two polypeptides of them were obtained with AA 17.45%after purification.In soybean,several polypeptides with AA 30.72%were obtained from the crude proteins with AA 10.52%.This method was a novel,rapid and effective method for preparation of antioxidant proteins from ginkgo and soybean.
hemin;affinity chromatography;ginkgo;soybean;antioxidant protein
TS201.2+1
B
1002-0306(2012)01-0278-04
2010-05-17 *通訊聯(lián)系人
王桂珍(1984-),女,在讀碩士研究生,研究方向:蛋白質工程。
暨南大學自然科學基金(640073)。