葛錫娟，趙城彬，楊麗麗，吳 非

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

大豆抗癌肽的分離純化及分子量分布

葛錫娟，趙城彬，楊麗麗，吳 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

為確定具有抗癌活性大豆多肽的分子量，對大豆抗癌肽粗提物進行超濾，采用MTT法（四噻唑藍比色法）對得到的不同組分超濾液進行抗癌活性檢測，初步確定分子量在5000～10000u范圍的組分具有最高的抑癌活性，大豆抗癌肽的IC50為0.47mg/mL。用葡聚糖Sephadex G-75凝膠柱對該組分進行進一步分離，收集各洗脫組分并進行抗癌活性研究。結(jié)果顯示：組分A4具有最佳的抗癌活性，其IC50為0.37mg/mL。根據(jù)分子量標準曲線，得到其平均相對分子質(zhì)量為6723u。

大豆多肽，抗癌活性，凝膠過濾，相對分子量

抗癌活性肽（anti-cancer bioactive peptide，ACBP）最早是蘇秀蘭等從山羊臟器中提取的一種低分子活性物質(zhì)[1]。大豆抗癌肽是一類具有抑制腫瘤生長、對化療藥物有增敏作用等的大豆多肽。Ben O deLumen等[2]、Hyung等[3]研究顯示，大豆中含有一種新型的預(yù)防癌癥的物質(zhì)Lunasin，通過抑制核心組蛋白乙?；瘡亩鸢┘毎蛲觯@對抑制癌細胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有重要意義。國內(nèi)對大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血壓性、降血脂和降膽固醇方面[4-6]，有關(guān)大豆中抗癌肽的研究較少。具有抗癌活性的大豆多肽分子量分布也未見報道。實驗以胃癌SGC7901細胞增殖抑制率為檢測指標，先將大豆粗提物進行超濾，采用MTT法對不同分子量范圍超濾液的抗癌活性進行研究。將有最佳抗癌活性的超濾組分用葡聚糖Sephadex G-75凝膠層析進行進一步的分離，收集各洗脫組分進行抗癌活性檢測，確定具有最佳抗癌活性的洗脫組分。通過分子量標準曲線計算大豆抗癌肽的分子量。以期為大豆抗癌肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也為下一步制備特定功能的大豆多肽奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；人胃癌細胞SGC7901 博士得試劑公司；葡聚糖凝膠G-75 美國GE公司；RPMI1640 上海索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（FBS） 杭州四季青生物工程材料有限公司，使用前56℃滅活30min，4℃保存；胰蛋白酶（Typein，1∶250），溶于上述0.01mol/L的PBS，濃度為0.25%，過濾除菌，-20℃冰箱保存、噻唑藍（MTT，3（4，5-dimethylthiazo2-yl）2，5-diphenyltetrazolium Bromide），溶于上述0.01mol/L的PBS，濃度為5mg/mL，過濾除菌，4℃冰箱避光保存 美國Amresco公司。

酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BIO-RAD；超濾裝置（超濾膜截留分子量分別為10000、5000u，型號分別為CLS-K-I-A10000，CLS-K-I-A5000） 北京中科膜技術(shù)有限公司；AKTA explorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；Frac-950收集器；LGJ-1冷凍干燥機 上海醫(yī)用離心機廠；IMT-413倒置熒光顯微鏡 日本OLYMPUS；超聲波震蕩儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；CO2培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計 上海偉業(yè)儀器廠；1000μL微量進樣器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆抗癌肽的提取 干燥的大豆1kg粉碎后，用乙醚進行脫脂，脫脂粉烘干過80目篩。取3g脫脂大豆粉，加入PBS緩沖溶液15mL（pH7.4），40℃條件下超聲波處理80min，每隔10min攪拌一次。將處理后的溶液使用截留分子量為1000u的透析膜對粗提物水溶液進行透析（4℃，24h），除去鹽、少量有機溶劑及生物小分子雜質(zhì)等。將透析液取出離心（20000×g，30min，4℃），轉(zhuǎn)移上清液，備用。

1.2.2 大豆抗癌肽的分離純化

1.2.2.1 超濾分離粗品大豆抗癌肽 將上述制得的大豆抗癌肽粗提液過截留分子量為5000u的超濾膜，再將其透過液過截留分子量為10000u的超濾膜。分別獲得分子量在gt;10000、5000～10000、lt;5000u三個組分。收集各組分多肽液進行冷凍干燥，通過計算各組分的IC50，初步確定具有抗癌活性的大豆多肽分子量范圍。

1.2.2.2 凝膠層析分離純化大豆抗癌肽 將Sephadex G-75凝膠用蒸餾水浸泡24h以上，裝柱。取1.2.2.1中具有最高抑癌率組分凍干粉0.1g溶于10mL緩沖液，進行層析分離。分離條件是上樣量0.5mL，流速為0.5mL/min，洗脫液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，室溫，檢測波長為280nm。用部分收集器收集多肽洗脫峰，收集量3mL/管。對各洗脫峰分別進行體外細胞實驗，計算抑癌率。

1.2.3 大豆抗癌肽分子量分布的初步測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 將分子量已知的標準品a牛血清白蛋白（分子量66000）、b卵白蛋白（分子量44000）、c胰蛋白酶（分子量21000）、d溶菌酶（分子量14000）和e胰島素（分子量5500）分別稱取20mg溶解于3mL pH為8的磷酸鹽緩沖溶液中溶解，制成標準溶液。

將已處理好的交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-75）裝柱，用洗脫液洗脫至基線平穩(wěn)。五種配制好的蛋白質(zhì)標準品溶液混合振蕩均勻后，抽取混合液1mL上樣，在280nm分別檢測蛋白質(zhì)吸光值。根據(jù)標準品分子量對數(shù)與保留時間關(guān)系建立線性方程，并繪制標準曲線。

1.2.3.2 大豆抗癌肽分子量的計算 按照體外細胞實驗結(jié)果，計算并比較各組分抑癌率大小，確定大豆抗癌肽出峰時間。通過分子量標準曲線，計算大豆抗癌肽的分子量。

1.2.4 抗癌活性測定-MTT法 將對數(shù)成長期的胃癌細胞SGC7901用1mL 0.25%的胰蛋白酶消化。待細胞變圓后吸出胰蛋白酶。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（pH7.4）沖洗分散細胞，細胞計數(shù)后以每孔4000～5000個/200μL細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μL。將培養(yǎng)板移入5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將經(jīng)分離純化的大豆抗癌肽溶液過0.22μm濾膜除菌，每孔分別加入濾液100μL，同時設(shè)置5個平行孔。并設(shè)陰性對照組（含同一細胞密度的培養(yǎng)液）和溶劑對照組（200μL RPMI1640培養(yǎng)液）。加完后繼續(xù)孵育48h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃，繼續(xù)孵育4h后，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩15min，使藍紫色甲瓉結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值（OD490），記錄結(jié)果。按下列公式求出生長抑制率（IR）和半數(shù)致死濃度IC50。

IC50=細胞生長抑制率為50%的藥物質(zhì)量濃度。

根據(jù)計算出的IR值按以下標準判斷提取物的敏感性：IRgt;50%，高度敏感；30%≤IR≤50%，敏感；IRlt; 30%，不敏感；采用均數(shù)±標準差（±s）進行結(jié)果分析。1.2.5 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0分析處理數(shù)據(jù)，用Probit、ANOVA進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離大豆抗癌肽

實驗以對胃癌細胞SGC7901的生長抑制作用作為反映抗癌活性的指標，通過初次篩選，發(fā)現(xiàn)大豆粗提物對癌細胞的生長抑制率隨加樣濃度升高而升高，最高抑制率分別為44.84%、69.34%、50.32%（見表1）。

根據(jù)IC50的定義，采用SPSS的Probit計算得分子量小于5000u、5000～10000u、大于10000u三種組分的IC50值分別為1.17、0.47、0.96mg/mL。比較各組分半數(shù)致死濃度（IC50）值可知，分子量在5000～10000u的組分對癌細胞的抑制作用最佳，此時的IC50≈0.47mg/mL。因此，初步確定大豆抗癌肽的分子量范圍在5000～10000u。

表1 大豆粗提物超濾后各組分癌細胞抑制率（±s）和IC50值Table 1 Cancer cell inhibition rate of soybean extract components after ultrafiltration（±s）and IC50value

表1 大豆粗提物超濾后各組分癌細胞抑制率（±s）和IC50值Table 1 Cancer cell inhibition rate of soybean extract components after ultrafiltration（±s）and IC50value

組分（mg/mL） gt;10ku 5～10ku ＜5ku細胞生長抑制率（%） IC50（mg/mL） 細胞生長抑制率（%） IC50（mg/mL） 細胞生長抑制率（%） IC50（mg/mL）0.1 4.08±3.09 17.58±4.442 12.02±5.45 0.2 28.46±4.81 37.59±6.87 18.69±7.07 0.4 26.26±5.80 1.17 41.12±10.36 0.47 26.28±8.58 0.96 0.6 29.56±1.91 58.78±9.53 39.11±4.54 0.8 44.84±2.31 69.34±6.49 50.32±7.02

2.2 凝膠層析分離純化大豆抗癌肽結(jié)果

對經(jīng)超濾得到的相對分子質(zhì)量在5000～10000u的多肽液進行Sephadex G-75柱層析分離，分別收集洗脫峰并編號A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10（見圖1），經(jīng)過多次分離收集樣品并凍干。將收集的各組分配成濃度為0.1mg/mL溶液，進行抗癌活性檢測，結(jié)果見表2。

圖1 大豆抗癌肽的SephadexG-75凝膠洗脫圖譜Fig.1 SephadexG-75 gel elution profile of soybean anticancer peptide

表2 各洗脫組分的OD值和癌細胞抑制率（±s）Table 2 OD value and cancer cell inhibition rate of each eluted fractions（±s）

表2 各洗脫組分的OD值和癌細胞抑制率（±s）Table 2 OD value and cancer cell inhibition rate of each eluted fractions（±s）

組別 OD值 生長抑制率（%）空白組 0.136±0.052對照組 0.324±0.016 A1 0.293±0.015 16.57±7.68 A2 0.322±0.008 1.17±5.67 A3 0.276±0.021 25.50±6.57 A4 0.262±0.012 33.15±9.01 A5 0.272±0.018 27.73±8.06 A6 0.315±0.014 5.10±3.41 A7 0.294±0.017 16.25±8.03 A8 0.312±0.015 6.37±5.76 A9 0.281±0.20 23.16±9.31 A10 0.321±0.011 2.02±6.86

由表2可知，組分A1～A10中，A4的抗癌活性最高，生長抑制率IR=33.15%＞30%，具有敏感的抗癌性。其次是組分A5，它的生長抑制率IR=27.73%＜30%，因此對癌細胞的生長抑制不敏感?？拱┗钚宰畹偷氖墙M分A2，抑癌率只有1.17%。各組分的抗癌活性依次為A4＞A5＞A3＞A9＞A1＞A7＞A8＞A6＞A10＞A2。將A4組分配成不同濃度（0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的溶液，根據(jù)細胞抑制率（17.58%、20.96%、30.59%、35.67%、40.2%、46.7%、45.5%、44.4%、56.3%）計算其IC50為0.37mg/mL。明顯優(yōu)于超濾后的抗癌肽組分（IC50≈0.47mg/mL），說明純化效果較好。

由于肽結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其抗癌機理也比較復(fù)雜。肽的抗癌活性一方面與其特定的氨基酸組成有關(guān)；另一方面還與其氨基酸序列有密切聯(lián)系。如Lunasin，其抗癌作用是因為在它的C-末端有8個天冬氨酸殘基，當它們結(jié)合到核染色質(zhì)區(qū)域后（比如出現(xiàn)在著絲點），它們對抗有絲分裂效應(yīng)起到很大的作用。結(jié)果，著絲點處復(fù)合物不能正常形成，微管不能連到著絲點上，導(dǎo)致有絲分裂停止，細胞最終死亡，從而起到抑制癌細胞增殖的作用[7]。

2.3 大豆抗癌肽分子量的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 按上述分離方法測定各已知分子量標準物的保留時間，記錄蛋白標準品的最大吸收峰出現(xiàn)時的保留時間（min），測定結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)標準品的SephadexG-75凝膠洗脫圖譜Fig.2 SephadexG-75 gel elution profile of protein standard

以保留時間為橫坐標，以lgM為縱坐標，繪制標準曲線如圖3。

圖3 分子量標準曲線Fig.3 Molecular weight standard curve

由圖3可見，分子量對數(shù)與保留時間呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=-0.0817x+6.4632，R2=0.988。式中，X代表保留時間，Y代表分子量對數(shù)，0.988為標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)。由此可知，各分子量的對數(shù)值與各標樣的保留時間具有良好的線性關(guān)系，可以準確地根據(jù)此回歸方程計算出提取物中抗癌肽分子量分布。

2.3.2 大豆抗癌肽分子量的確定 大豆抗癌肽粗品經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾分離結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，提取物有三個明顯的洗脫峰A4、A5、A9，體外細胞實驗結(jié)果表明，組分A4具有較佳的抑癌性。這三個洗脫峰的保留時間分別為32.26、47.06、80.27min，其中A9分子量較小主要是一些鹽類。根據(jù)回歸方程計算得A4、A5的平均分子量分別為6723u和420u。根據(jù)各組分的癌細胞抑制率可知，經(jīng)過分離純化后大豆抗癌肽的平均相對分子質(zhì)量為6723u。

國外有關(guān)大豆抗癌肽及相關(guān)的報道中，介紹一種全新的大豆抗癌肽Lunasin可以抑制哺乳動物細胞核心組蛋白的乙酰化。其拮抗化學誘癌物和致癌基因的功效已在哺乳動物細胞和一種皮膚癌小鼠模型上得到證實。盡管具有癌癥預(yù)防特性，Lunasin并不影響正常細胞和已確立癌細胞株的生長。目前認為其作用的后生性機制為，Lunasin通過與細胞轉(zhuǎn)化事件中暴露出的脫乙?；暮诵慕M蛋白的結(jié)合，破壞組蛋白乙?；?脫乙酰化的動力學過程并導(dǎo)致細胞死亡，從而選擇性地殺死正在轉(zhuǎn)化或者新近轉(zhuǎn)化的細胞[8]。Lunasin是從大豆中分離和定性的，在所分析的美國各種基因型大豆中均有發(fā)現(xiàn)[9]。體外抑癌實驗顯示，國產(chǎn)大豆中提取的抗癌肽對癌細胞也有一定的抑制作用。另外，研究表明Lunasin分子量小于8ku，而本實驗提取的大豆平均相對分子質(zhì)量為6723u，所以該抗癌肽有可能是Lunasin，但實驗中所做僅是初步觀察，仍需要進一步的實驗研究來探討。

3 結(jié)論

近年來對大豆多肽類物質(zhì)研究較多的是它的抗氧化性，然而對大豆多肽的抗癌活性較少報道。本實驗結(jié)果表明，大豆多肽分子量在5000～10000u時具有最高的抑癌活性，此時，大豆抗癌肽的IC50為0.47mg/mL。樣品經(jīng)凝膠過濾分離純化后，體外細胞實驗結(jié)果顯示：組分A4具有最佳抗癌活性，IC50為0.37mg/mL；在0.1mg/mL濃度下，其IR值為33.15%＞30%，具有敏感的抗癌性；通過標準曲線計算大豆抗癌肽的平均相對分子質(zhì)量為6723u。

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Purification and distribution of molecular weight of soybean anti-cancer peptides

GE Xi-juan，ZHAO Cheng-bin，YANG Li-li，WU Fei*
（College of Food Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To determine the molecular weight of soybean peptides with anti-cancer activity，the extraction of soybean anti-cancer peptides was ultrafiltrated.MTT（thiazole blue four）assay was used to detect the anticancer activity of different components obtained by ultrafiltration.Components of soybean anti-cancer peptides with molecular weight ranging from 5000 to 10000u had the highest anti-cancer activity，and the IC50of soy anti-cancer peptides was 0.47mg/mL.Gel Filtration Chromatography（Sephadex G-75）was applied to further separate and collect all of fractions in order to research the anti-cancer activity.The results showed that：A4 components had the best anti-cancer activity，and its IC50was 0.37mg/mL.According to standard curve of molecular weight，average molecular weight of A4 was about 6723u.

soybean peptides；anti-cancer activity；gel filtration；relative molecular weight

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）03-0099-04

2011－02－21 *通訊聯(lián)系人

葛錫娟（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

黑龍江省攻關(guān)項目（GA09B401-2）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才基金項目（2008RFQXN016）。