劉鄰渭，袁 琳，孫麗芳，唐麗麗

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100）

8種葉片葉綠素提取得率、穩(wěn)定性和應(yīng)用效果的對(duì)比

劉鄰渭1，袁 琳1，孫麗芳1，唐麗麗2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌712100）

以8種葉片為原料，對(duì)葉綠素相對(duì)提取得率、提取物的穩(wěn)定性以及在食品應(yīng)用的效果進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明：葉片干燥方法對(duì)原料的提取得率有一定影響；以80%乙醇為提取劑于50℃下提取葉綠素相對(duì)較佳；從菠菜、青菜、雪松、令箭荷花、海桐、石楠、冬青、女貞提取葉綠素的得率依次降低；陽光直射、pH降低和溫度升高加快提取液中葉綠素的降解；多數(shù)葉片提取物的降解變化趨勢總體相同，青菜和令箭荷花葉片提取物的變化顯示出某些個(gè)性特點(diǎn)；添加葉綠素制作湯圓、果凍和糖果時(shí)效果良好，而制作冰淇淋和酸奶時(shí)效果較差。

葉綠素，提取，穩(wěn)定性，應(yīng)用

葉綠素是良好的天然食用色素，近年來，有關(guān)研究指出葉綠素具有抵抗輻射、強(qiáng)健肌肉、造血、解毒、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、減緩化療負(fù)作用、維持血細(xì)胞健康等保健作用[1-13]，因而興起了生產(chǎn)葉綠素保健品的勢頭。目前，提取葉綠素的原料以蠶砂、竹葉和大麥苗等為主，而研究過的其它原料還包括菠菜、芹菜、萵筍、甘藍(lán)、油菜、豆芽菜苗、青草、三葉草、仙人掌、蘆薈、甘蔗葉、甜菜葉、海藻、螺旋藻、浮萍、茶葉、多種竹葉、桑葉、松針、香蕉葉、獼猴桃葉、桃葉、大葉黃楊、絞股藍(lán)葉、牡丹葉和紫丁香葉等[12-31]。然而，同時(shí)從多種原料中提取葉綠素并測試其穩(wěn)定性的比較研究卻鮮見報(bào)道。為此，本文以兩種喬木葉片、三種灌木葉片、一種花卉葉片和兩種蔬菜葉片為原料，以乙醇水溶液為提取溶劑，以提取液和處理液在特定波長下的吸光度表示其葉綠素含量，比較了這些葉片葉綠素的相對(duì)提取得率、穩(wěn)定性和食品應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喬木葉片-女貞、雪松葉片，灌木葉片-海桐、石楠、冬青葉片，花卉葉片-令箭荷花葉片，蔬菜葉片-菠菜、青菜葉片 均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)冬季的校園；95%乙醇、無水乙醇、檸檬酸 均為分析純，市售。

電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，粉碎機(jī)，電子天平，水浴鍋，721型分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素的提取及方法優(yōu)化

1.2.1.1 原料的預(yù)處理 方法一：將洗凈、瀝水、擦干的8種新鮮葉片分別攤開放置于陰涼處，陰干，粉碎，過60目篩后備用。方法二：將洗凈、瀝水、擦干的8種新鮮葉片分別攤開放置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，40℃烘干，粉碎，過60目篩后備用。

1.2.1.2 95%乙醇提取陰干葉葉綠素 準(zhǔn)確稱取按照1.2.1.1方法一預(yù)處理的8個(gè)樣品各0.2g，分別置于8支試管中，各加3mL 95%乙醇，用橡皮塞塞好，振蕩三次，在40℃的水浴條件下浸提2h，隨后分別過濾到8個(gè)25mL的容量瓶中，用95%乙醇定容后，測定吸光度。

1.2.1.3 采用乙醇水溶液提取陰干葉葉綠素 將1.2.1.2的提取方法中的稱樣量由0.2g更改為0.1g，將95%乙醇提取劑分別改變?yōu)?0%、60%、80%乙醇水溶液，將定容溶劑改為80%乙醇，其它操作同1.2.1.2。

1.2.1.4 采用不同干燥方法提取葉綠素 準(zhǔn)確稱取按照1.2.1.1方法一和方法二預(yù)處理的16個(gè)樣品各0.1g，以80%乙醇水溶液為提取劑，其它操作同1.2.1.2。

1.2.1.5 采用不同溫度提取葉綠素 準(zhǔn)確稱取按照1.2.1.1方法一預(yù)處理的雪松、女貞、冬青和石楠以及按照1.2.1.1方法二預(yù)處理的海桐、令箭荷花、波菜和青菜干燥葉粉樣品各0.1g（每種樣品取兩份），分別置于等大16支試管中，加3mL 80%乙醇，用橡皮塞塞好，振蕩三次，然后將每一相同的兩份樣品分置于40℃和50℃水浴中浸提2h，隨后分別過濾到16個(gè)25mL的容量瓶中，用80%乙醇定容后，測定吸光度。

1.2.2 葉綠素相對(duì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 提取液的準(zhǔn)備 按照1.2.1.5中50℃水浴的提取方法，但將葉粉稱樣量和提取劑用量分別加大10倍，以及將提取時(shí)間改為1h，提取后過濾、定容至50mL，共得到8種葉子的葉綠素提取液。

1.2.2.2 不同pH下葉綠素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液的配制：將配制的0.2mol/L檸檬酸乙醇水溶液和0.1mol/L磷酸氫二鈉乙醇水溶液按照一定比例配制成pH分別為2.2、3.8、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液。

實(shí)驗(yàn)方法：按照pH從低到高的順序分別將6種pH緩沖溶液加到6組大試管中，每組8支試管，每管7mL，然后，分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各3mL移加到這6組共48個(gè)大試管中，塞好橡皮塞，振蕩搖勻，放置于暗室，30min后取出，測定吸光度。

1.2.2.3 不同加熱溫度下葉綠素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各5mL移加到8支大試管中，在65、75、85、95℃四種溫度下水浴加熱30min后取出，轉(zhuǎn)入暗室冷卻后，各加80%乙醇定容為15mL，測定吸光度。

1.2.2.4 不同光照條件下葉綠素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別將1.2.2.1制備的8種葉子的葉綠素提取液各30mL移加到8個(gè)50mL的錐型瓶中，于中午12時(shí)放置于戶外光照5min，取出5mL用80%乙醇定容為15mL后，測定吸光度，其余放入暗室，第2d取出，按前1d的處理和測定方法再做一次，第3d和第4d按同樣處理和測定方法各再做一次。

1.2.3 葉綠素含量、相對(duì)提取得率和相對(duì)穩(wěn)定性的測定 葉綠素最強(qiáng)的可見光吸收區(qū)有兩處，即波長640～660nm的紅光吸收區(qū)和430～450nm的藍(lán)紫光吸收區(qū)，因此，葉綠素溶液在兩區(qū)內(nèi)的最大吸收和其濃度均成正比。依據(jù)這一原理，本研究將1.2.1中不同提取液和1.2.2中不同處理液作為兩類試樣，分別在436nm和666nm波長下測定各試樣的吸光度，并根據(jù)所有試樣制備時(shí)料液比相同，用試樣吸光度表示其葉綠素的相對(duì)含量，用提取液的吸光度表示葉綠素的“相對(duì)提取得率”，用處理試樣的吸光度變化趨勢表示葉綠素的“相對(duì)穩(wěn)定性”。

1.2.4 葉綠素提取物在食品中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1優(yōu)選的方法，分別提取8種葉片的葉綠素，提取液過濾濃縮后放入暗室備用。然后按照傳統(tǒng)食品加工工藝，并適量添加葉綠素，試制成食品，通過感官評(píng)比，比較不同葉片葉綠素在不同食品中的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉片葉綠素相對(duì)提取得率的初次對(duì)比

按1.2.1.2的方法制備好的葉綠素提取液的比色測定結(jié)果見表1。

表1 以95%乙醇為提取劑提取陰干葉片時(shí)葉綠素的相對(duì)提取得率Table 1 Relative yields of chlorophyll extracted with 95% ethanol from shade dried leaves

表1顯示，由8種葉片提取葉綠素溶液的吸光度的大小順序?yàn)椋翰げ耍厩嗖恕盅┧桑玖罴苫ǎ臼竞Ｍ径啵九?。這種排序可能和不同葉片中的葉綠素含量、提取條件、干燥方法以及不同葉片的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁厚度等有關(guān)。

2.2 不同提取劑提取葉綠素時(shí)相對(duì)提取得率的對(duì)比

按1.2.1.3的方法制備好的葉綠素提取液的比色測定結(jié)果見表2。

表2顯示，隨著提取溶劑乙醇濃度的升高，提取液的吸光度也隨之明顯升高，采用80%乙醇時(shí)的相對(duì)提取得率最高。比較表1和表2的數(shù)據(jù)并考慮到1.2.1.3實(shí)驗(yàn)使用的原料只有1.2.1.2實(shí)驗(yàn)使用的原料的一半，可以確定，使用80%乙醇比使用95%乙醇為提取劑時(shí)的相對(duì)提取得率高。所以80%乙醇為優(yōu)選提取劑。

表2 乙醇濃度對(duì)葉綠素相對(duì)提取得率的影響Table2 Influenceofethanolconcentrationonthechlorophyllyield

2.3 不同干燥方法對(duì)相對(duì)提取得率的影響

按1.2.1.4的方法制備好的16種提取液的比色測定結(jié)果見表3。

表3 葉片干燥方法對(duì)葉綠素相對(duì)提取得率的影響Table 3 Influence of the leaf drying methods on the chlorophyll yield

表3的數(shù)據(jù)顯示，無論從436nm波長處的吸光度，還是從在666nm波長處的吸光度看，陰干的女貞、雪松、冬青、石楠葉片的葉綠素提取得率高于烘干的，而烘干海桐、令箭荷花、菠菜和青菜葉片的葉綠素提取得率明顯高于陰干的。

2.4 提取溫度對(duì)相對(duì)提取得率的影響

表4 提取溫度對(duì)葉綠素相對(duì)提取得率的影響Table 4 Influence of extraction temperature on the chlorophyll yield

按1.2.1.5的方法制備好的16種提取液的比色測定結(jié)果見表4。

表4顯示，隨著提取溫度由40℃改為50℃，提取液吸光度都有一定的提高，即葉綠素的相對(duì)提取得率增加。比較表1～表4中的吸光度可知，按照1.2.1.5方法包含的其他提取條件，并采用50℃提取，是本文優(yōu)選的最佳提取條件。在此條件下，從8種葉片提取葉綠素的相對(duì)得率的高低順序?yàn)椋翰げ耍厩嗖耍狙┧伞至罴苫ǎ竞Ｍ臼径啵九憽?/p>

2.5 pH對(duì)提取液葉綠素穩(wěn)定性的影響

按照1.2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 8種葉片葉綠素提取液在不同pH下吸光值（A436nm）的變化Fig.1 OD436nmof the extracted solutions from 8 kinds of leaves under different pH

圖2 8種葉片葉綠素提取液在不同pH下吸光值（A666nm）的變化Fig.2 OD666nmof the extracted solutions from 8 kinds of leaves under different pH

圖1和圖2顯示，8種葉片的提取液經(jīng)調(diào)整pH后放入暗室30min，其葉綠素的兩個(gè)主要吸收峰都有所下降，pH越低，下降越快；除了青菜源葉綠素提取液在436nm下的吸光度變化為曲線外，其它葉片提取液吸光度的變化曲線基本都為較陡的直線。

2.6 溫度對(duì)提取液中葉綠素穩(wěn)定性的影響

圖3 8種葉片葉綠素提取液在不同溫度值下吸光值（A436nm）的變化Fig.3 OD436nmof the extracted solutions from 8 leaves under different temperature

按照1.2.2.3制備樣品后，分別在436nm和666nm波長下測定吸光度后，以溫度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，分別制出圖3和圖4。

在“雙創(chuàng)”時(shí)代背景下，高職院校教師必須與時(shí)俱進(jìn)，不斷提高自身的核心素養(yǎng)和能力，為學(xué)生做出良好的榜樣，為培養(yǎng)出滿足“雙創(chuàng)”型人才奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。高職教師核心素養(yǎng)和能力［2］主要包括高職教師的教育理念與師德素養(yǎng)、教學(xué)和教改能力、專業(yè)實(shí)踐和指導(dǎo)能力、信息化應(yīng)用及科研能力、創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力等。高職院校應(yīng)該充分地利用“政校行企”四方聯(lián)動(dòng)的模式，構(gòu)建雙創(chuàng)型的教師隊(duì)伍，促進(jìn)教師核心素養(yǎng)和能力的全面提升。

圖3和圖4顯示，8種葉片的提取液經(jīng)加熱30min后，其葉綠素的兩個(gè)主要吸收峰都有所下降，加熱溫度越高，下降越快；除了令箭荷花葉片葉綠素提取液的吸光度隨溫度升高較快下降外，其它7種葉片提取液在前四種溫度范圍內(nèi)吸光度的變化曲線基本都為較平的直線，而98℃處理后的降幅一般有所加大。

圖4 8種葉片葉綠素提取液在不同溫度值下吸光值（A666nm）的變化Fig.4 OD666nmof the extracted solutions from 8 leaves under different temperature

2.7 光照對(duì)提取液中葉綠素穩(wěn)定性的影響

按照1.2.1.3制備樣品后，分別在436nm和666nm波長下測定吸光度，以凈光照時(shí)間累積值為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，分別制出圖5和圖6。

圖5 8種葉片葉綠素提取液在不同光照時(shí)間處理后吸光值（A436nm）的變化Fig.5 OD436nmof the extracted solutions from 8 leaves exposed to sun for different time

圖6 8種葉片葉綠素提取液在不同光照時(shí)間處理后吸光值（A666nm）的變化Fig.6 OD666nmof the extracted solutions from 8 leaves exposed to sun for different time

圖5和圖6顯示，雖然每天實(shí)驗(yàn)的光照時(shí)間都只是短短的5min，但隨著光照的進(jìn)行，8種葉片葉綠素提取液的吸光度顯著降低；隨著累積光照時(shí)間延長，8種葉片葉綠素提取液在兩種波長下的吸光度基本都呈曲線下降（唯有青菜葉片提取液在436nm下的吸光度幾乎呈直線下降），說明前兩次的5min光照對(duì)葉綠素的降解作用最強(qiáng)。

2.8 葉綠素提取物在食品中的應(yīng)用效果比較

加入各種葉片葉綠素的湯圓煮熟后皆為綠色，其中加菠菜葉綠素的湯圓色澤最為鮮艷翠綠。

加入各種葉片葉綠素的酸奶開始時(shí)都呈現(xiàn)出淡淡的綠色，低溫保存短期內(nèi)不明顯褪色，但總體感官效果都較差。

加入各種葉片葉綠素的果凍色澤皆為翠綠，透明度較好，與添加人工色素制成的果凍相比，其綠色顯得更為自然。

添加了各種葉片葉綠素的糖果顏色自然鮮綠，透明度好。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

陰干的女貞、雪松、冬青、石楠葉片的葉綠素提取率略高于烘干的，而烘干海桐、令箭荷花、菠菜和青菜葉片的葉綠素提取率明顯高于陰干的；采用料液比為1∶30，以80%乙醇為提取劑，于50℃下提取葉綠素是本文選出的相對(duì)最佳提取條件。

在本文選出的最佳提取條件下，由8種葉片提取葉綠素的相對(duì)得率的大小順序?yàn)椋翰げ耍厩嗖耍狙┧伞至罴苫ǎ竞Ｍ臼径啵九妗?/p>

8種葉片的葉綠素提取液對(duì)光照都極為敏感，短時(shí)間日光直射即可引起大幅褪綠。

8種葉片的葉綠素提取液對(duì)pH都較為敏感，隨著pH降低，穩(wěn)定性近乎線性降低。

在86℃以下，除了令箭荷花葉片外，其它葉片的葉綠素提取液對(duì)加熱不敏感，但溫度上升至98℃以上，多數(shù)葉片葉綠素降解明顯加快，唯有菠菜葉片葉綠素提取液仍很穩(wěn)定。

葉綠素加入湯圓、糖果和果凍的效果良好，加入冰淇淋和酸奶中的效果不理想。

3.2 討論

從本文研究結(jié)果中看，葉片干燥方法可能是影響葉綠素提取得率的一個(gè)重要因素，而且不是由水分含量差異引起。這是因?yàn)?，如果陰干葉片和烘干葉片水分含量的不同是提取得率不同的主要原因，那么實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該是，8種葉片陰干提取得率都高，或是8種葉片烘干提取得率都高。

從本文的研究結(jié)果看，從不同原料提取葉綠素的得率有一定差異。這肯定與原料的葉綠素含量不同有關(guān)，但也和不同葉片提取時(shí)的pH之間差異有關(guān)。

從本文的研究結(jié)果看，多數(shù)葉片提取液中葉綠素在環(huán)境條件影響下的降解趨勢彼此基本一致，但個(gè)別葉片提取液中葉綠素的穩(wěn)定性可表現(xiàn)出一定特殊性，例如，菠菜提取液中葉綠素?zé)岱€(wěn)定性高、令箭荷花提取液中葉綠素?zé)岱€(wěn)定性低，這可能與菠菜堿性相對(duì)較高，有利于葉綠素穩(wěn)定有關(guān)；葉綠素處于乙醇水溶液中時(shí)特別易于光降解。事實(shí)上，前人在研究菠菜汁葉綠素穩(wěn)定性時(shí)已發(fā)現(xiàn)，葉綠素對(duì)紫外光的敏感性遠(yuǎn)大于對(duì)pH、溫度和氧含量的敏感性[32]，前人在研究對(duì)比葉綠素含量的不同測定方法時(shí)也已發(fā)現(xiàn)，用乙醇-丙酮-水混合液比用乙醇-丙酮混合液、用無水乙醇、二甲亞砜等為溶劑時(shí)更易發(fā)生光氧化[33]。

從本文應(yīng)用葉綠素實(shí)驗(yàn)效果可推知，將葉綠素提取物加入到較為透明的低酸食品中，可帶來美麗的綠色，并具有一定穩(wěn)定性；但將葉綠素提取物加入到以水為介質(zhì)的粗分散系或酸性食品中的效果不佳，這可能是因?yàn)槿~綠素水溶性差和具有酸不穩(wěn)定性，粗分散顆粒的光散射作用也減少了葉綠素的色感。

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Comparison of extraction rates，stabilities and application properties of chlorophyll from 8 kinds of leaves

LIU Lin-wei1，YUAN Lin1，SUN Li-fang1，TANG Li-li2
（1.College of food Science and Technology，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China；2.Shaanxi Yangling Vocational and Technical College，Yangling 712100，China）

Chlorophyll was extracted from 8 kinds of dried leaves respectively.And the yields，stability and application effect were compared with each other.The results showed that：extraction yields for some leaves relied significantly to the leaves’drying method.The optimized extraction temperature and agent were 50℃and 95%alcohol solution.The extraction yields turned from the highest to the lowest one by one when the raw materials were spinach，greens，deodarcedar，nopalxochia ackermannii，pittosporum tobira Ait，photinia serrulata，holly，and ligustrum lucidum Aitleaves respectively.Chlorophyll in those extraction solutions degradated accelerately when exposing to sun light，lower pH and high temperature.The chlorophyll stabilities in most extracts were similar generally，but for the extracts from greens and nopalxochia ackermannii，which displayed somewhat differences.Adding concentrated extracts to glutinous rice ball，jelly and candy had gotten good results，but adding them to ice-cream and yogurt had not.

chlorophyll；extraction；stability；application

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0245-05

2010－07－16

劉鄰渭（1953-），男，教授，主要從事食品化學(xué)研究。