馬英輝，李利軍，王聯(lián)結(jié)，盧美歡

（1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043；2.陜西科技大學(xué)，陜西西安710021）

木質(zhì)纖維素酸水解液的脫毒方法研究

馬英輝1，李利軍1，王聯(lián)結(jié)2，盧美歡1

（1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043；2.陜西科技大學(xué)，陜西西安710021）

由于木質(zhì)纖維素的酸水解條件劇烈，水解液中必定存在影響微生物生長和發(fā)酵的物質(zhì)，特別是多酚類化合物，需對水解液進(jìn)行脫毒處理。通過探討8種脫毒方法對還原糖損失率和酚類脫出率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，樹脂XDA-1+ CaCO3，脫除酚類效果最好，還原糖損失率較低，并通過生物性檢驗也表現(xiàn)了良好的效果。

木質(zhì)纖維素，發(fā)酵抑制物，脫毒方法

雖然利用稀酸水解木質(zhì)纖維素，還原糖得率較高，但由于水解條件的劇烈程度使得水解液中還含有乙酸、糠醛以及木素的酸解產(chǎn)物（多羥基芳香化合物）等所謂的發(fā)酵抑制劑[1]，所以在水解液進(jìn)行酒精發(fā)酵之前必須對其進(jìn)行脫毒處理，盡量降低這些抑制物的濃度，以改善水解液發(fā)酵性能，提高產(chǎn)品的得率。對于乙酸和糠醛，在水解糖液濃縮時，可以借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其脫出[2]，但同時增大了多酚類毒性物質(zhì)的濃度，所以在濃縮前將其中的酚類物質(zhì)除去并且保證糖的損失率降到最低是關(guān)系到水解液發(fā)酵性能的關(guān)鍵。本文通過物理、化學(xué)、生物方法分別對水解液進(jìn)行脫除酚類處理并對其進(jìn)行了生物性檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜單寧管囊酵母（Pachysolen tannophilus 1771）購于中國菌種保藏中心；秸稈纖維素酸水解液 用稀磷酸水解所得；濃鹽酸，硫酸鋰，碳酸鈉-酒石酸鈉，丹寧-木質(zhì)素試劑，漆酶（1000LAMU/g），樹脂（XDA-7、XDA-1、D301）。

倒置成像顯微鏡（XDS-1B），層析柱，恒流泵。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂活化再生方法 按照參考文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 脫毒方法 a.用Ca（OH）2粉末將水解液中和至溶液pH=10.0，然后再用硫酸將pH調(diào)整為4.5，在1702N的離心力下離心15min，殘渣回收，取上清液為脫毒液A。

b.用CaCO3粉末將水解液中和至中性，再用硫酸將pH調(diào)整為4.5，在1702N的離心力下離心15min，殘渣回收，取上清液為脫毒液B。

c.將水解液用氨水中和至pH=5.0，按照液固比為10∶1（mL/g）加入活性炭，在25℃、100r/min攪拌1h，在1702N的離心力下離心15min，殘渣水洗烘干可重復(fù)利用，上清液為脫毒液C。

d.將水解液用氨水中和至pH=2.0，加入水解液1/3體積的乙酸乙酯，攪拌30min，靜置30min后，取下層液體為脫毒液D。

e.將水解液用氨水中和至pH=4.0，然后按8LAMU/mL加入漆酶，在50℃、120r/min進(jìn)行酶解處理，得脫毒液E，每隔4h取樣測定酚類化合物的脫出率。

f.將活化后的XDA-7樹脂以5∶1（v/w）液固比與水解液混合于300mL三角瓶中密封，在室溫（24℃）下，120r/min搖床作靜態(tài)吸附，12h測定吸附后溶液的木糖濃度和多酚化合物濃度。此溶液為脫毒液F。

g.將活化后的D301樹脂按照f相同的操作得脫毒液G。

h.XDA－1號樹脂活化后按照f相同的操作得脫毒液H。

1.2.3 生物學(xué)檢驗方法 將木質(zhì)纖維素水解液通過多酚脫除效果較好的XDA－1樹脂，隨后采用還原糖損失率較低的CaCO3中和方法進(jìn)行脫酚后水解液的中和，中和后調(diào)整糖濃度為15%，并加入3%的玉米胚粉，滅菌后按10%的接種量接入已活化好的嗜單寧管囊酵母，30℃，80r/min搖床培養(yǎng)30h后，利用倒置成像顯微鏡觀察各脫毒液酵母的生長情況，并計數(shù)，以考察XDA－7+CaCO3的脫毒效果。并以木糖培養(yǎng)液、XDA－7+CaCO3處理后的水解液、XDA－1+KOH處理后的水解液、Ca（OH）2過中和處理后的水解液和KOH中和處理后的水解液作為對比。

1.2.4 檢測分析方法 還原糖測定按參考文獻(xiàn)[4]；多羥基芳香化合物的測定按參考文獻(xiàn)[5]；生物學(xué)檢驗方法（觀察嗜單寧管囊酵母在脫毒液中的生長情況并計數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種脫毒方法的處理結(jié)果

表1 各種脫毒方法的效果Table 1 The effect of various detoxification methods

從表1可以看出，對多酚類脫除的效果順序是脫毒液H＞F＞G＞C＞E＞A＞B＞D，其中用XDA－1和XDA－7樹脂是動態(tài)吸附脫酚的，脫酚率都能達(dá)到接近90%，而從還原糖的損失率順序來看，E＜B＜H＜D＜A＜G＜F＜C，用CaCO3處理、XDA－1處理、乙酸乙酯萃取和漆酶處理，對還原糖的損失都不是很大，漆酶處理是一種生物處理方法，對還原糖的損失率只有4.14%，而漆酶也可以使小分子酚類化合物氧化聚合，毒性降低。據(jù)文獻(xiàn)介紹，利用產(chǎn)漆酶的絲狀軟腐菌去除柳樹半纖維素水解液中的抑制物質(zhì)，能夠使發(fā)酵時的最大乙醇產(chǎn)率提高3倍，最大可達(dá)4倍[6]。用CaCO3中和，還原糖損失率只有4.8%，但是它對酚類的脫出率只有45.13%，而根據(jù)文獻(xiàn)，用Ca（OH）2過中和處理和D301大孔樹脂吸附處理能夠有效的除去酚類化合物[7]，但從本實驗來看，用Ca（OH）2過中和處理后，還原糖損失率達(dá)到近30%，酚類的脫出率也僅有50%，而用D301樹脂動態(tài)吸附后，酚類脫除率最高可達(dá)84.4%，但是還原糖損失率達(dá)29.17%。所以結(jié)合還原糖的損失和對酚類的脫除效果，選擇XDA－1樹脂動態(tài)吸附酚類后，流出液再用CaCO3中和的方法對水解液進(jìn)行脫毒處理為最佳。

2.2 生物檢驗

2.2.1 嗜單寧管囊酵母在纖維素水解脫毒液中生長30h后的情況（稀釋104倍） 從圖1中a、b可以看出，用XDA－1動態(tài)吸附后再用CaCO3中和所得的水解脫毒液經(jīng)過真空濃縮培養(yǎng)酵母，生長情況與純糖培養(yǎng)基本上沒有差別，酵母生長健壯，并出現(xiàn)出芽生殖現(xiàn)象。說明此脫毒方法有效地去除了影響酵母生長的抑制因子，對酵母生長的調(diào)整期并沒有很大的影響。

從圖1－c可以看出，酵母生長緩慢，個體較小，生長極不均勻，出芽率相對較低，并出現(xiàn)少部分裂解，存在明顯的調(diào)整期延長現(xiàn)象，說明XDA－7樹脂的脫酚能力亞于XDA－1樹脂。

從圖1－d中可以看出，同樣的稀釋倍數(shù)，而圖中視野內(nèi)酵母細(xì)胞數(shù)量較少，并且處于生長停滯狀態(tài)，未見酵母芽體的出現(xiàn)，說明培養(yǎng)液中存在大量的磷酸根離子和K+造成細(xì)胞滲透壓過大，影響了酵母的生長。

從圖1－e中可以看出，用Ca（OH）2過中和處理的秸稈水解液，酵母細(xì)胞的生長性要優(yōu)于d和f，但相對于用XDA－1樹脂處理的水解液還有一定的差距，而且用Ca（OH）2過中和處理對糖的損失率比較高，酚類的脫除也未達(dá)到促進(jìn)菌種旺盛生長的要求，因而酵母雖有一定的出芽率，但仍不能達(dá)到后續(xù)發(fā)酵的要求。

從圖1－f中可以看出KOH處理的水解液接入酵母后，酵母生長狀況最差，酵母基本沒有生長的跡象，因為用KOH中和，溶液中存在高濃度木質(zhì)素的降解產(chǎn)物，另外還有高濃度的磷酸根離子和K+對酵母的生長都造成了嚴(yán)重的影響。

圖1 不同脫毒方法對酵母生長的影響（100×）Fig.1 The effect on the Pachysolen tannophilus cell with different detoxification methods

2.2.2 秸稈脫毒水解液中單位體積酵母菌數(shù)對比 從表2可以看出，只有XDA-1+CaCO3處理的秸稈水解液對嗜單寧管囊酵母的毒性最小，與純的糖培養(yǎng)基相似，說明經(jīng)過XDA-1+CaCO3后再經(jīng)真空濃縮處理，確實能夠解除羧酸、呋喃衍生物以及酚類化合物對酵母的抑制作用，但并不是脫毒后的水解液中不存在這些物質(zhì)，而是通過降低某類物質(zhì)的濃度來解除了多種抑制劑之間的協(xié)同抑制作用，而單一的抑制劑對酵母的生長抑制作用在低濃度下要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于協(xié)同抑制作用。但是對于多羥基芳香化合物，在低濃度下，即使mg/L級就可以明顯抑制酵母生長和后續(xù)的乙醇發(fā)酵[8]，所以對于單一關(guān)鍵物質(zhì)的脫除是解除單一抑制和協(xié)同抑制的重要途徑。從表1、表2可知，XDA-1動態(tài)吸附是脫除酚類最好的方法，這樣不但能夠回收部分酚類物質(zhì)，還達(dá)到了脫毒的目的；而其他方法處理后并未能改善酵母的生長情況，根據(jù)圖1，選擇XDA-1作為脫除酚類的最佳方法，結(jié)合采用CaCO3中和處理可以顯著提高秸稈水解液酵母的生長性和后續(xù)糖的可發(fā)酵性。

表2 培養(yǎng)30h后各種脫毒水解液中酵母菌生長量對比Table 2 Contrast the growth degree of yeast in different virus-free medium for 30h

3 結(jié)論與討論

酸法作為水解木質(zhì)纖維素的一種常用方法，在生產(chǎn)中已得到應(yīng)用，但是由于水解后水解液中發(fā)酵抑制物的存在，在很大程度上降低了發(fā)酵的效率，成為了限制酸法水解木質(zhì)纖維素廣泛應(yīng)用的重要因素。本文采用了各種脫毒方法對纖維素稀酸水解液進(jìn)行脫毒處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樹脂XDA-1+CaCO3脫除酚類效果最好，還原糖損失率較低，并通過生物性檢驗也表現(xiàn)了良好的效果，具有較好的前景，但成本問題有待于進(jìn)一步研究。隨著生物技術(shù)和化工工程的不斷發(fā)展，利用基因工程與分子生物學(xué)手段構(gòu)建或篩選出對發(fā)酵抑制劑具有一定抗性的菌株以及尋求低成本、高效率、對后續(xù)發(fā)酵影響小的木質(zhì)纖維素處理方法是今后研究的重點。

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Research on detoxification method of lignocellulose acid hydrolysate

MA Ying-hui1，LI Li-jun1，WANG Lian-jie2，LU Mei-huan1
（1.Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xi’an 710043，China；2.Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

As acid hydrolysis of lignocellulose was violent，the hydrolysates containes some compounds such as polyphenol which retarded the growth and fermentation of microorganisms.Therefore detoxification was needed. Eight kinds of detoxification methods were developed to study on xylose loss rate and the extrusion rate of phenols.The results showed that resin XDA-1+CaCO3was the best method for higher removal rate and lower xylose loss rate，and biological tests also showed good results.

lignocellulose；fermentative inhibitors；detoxification method

TS201.2+3

B

1002-0306（2012）01-0214-03

2011－01－13

馬英輝（1984-），男，研究方向：木質(zhì)纖維素燃料乙醇與微生物技術(shù)。