高運(yùn)華， 黎 朋， 侯東軍， 張 玲， 王 晶

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013；2.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

0 引言

核苷酸具有提高人體免疫力、促進(jìn)細(xì)胞再生與修復(fù)等生理功能[1]，配方奶粉中添加核苷酸已經(jīng)成為國際共識(shí)。而奶粉的質(zhì)量關(guān)系到千千萬萬嬰幼兒的健康成長[2]，關(guān)系到我國的社會(huì)穩(wěn)定，大頭娃娃事件、三聚氰胺事件等和其他嬰幼兒奶粉相關(guān)事件無不是關(guān)系到國家安定和國家榮譽(yù)的重大事件。目前，核苷酸的定量檢測方法主要包括高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[3-5]。試樣的前處理方法則包括固相萃取法、水解法、酶解法和沉淀雜質(zhì)法等[6-7]。高效液相色譜及高效毛細(xì)管電泳法利用核苷酸具有紫外吸收的特性，采用紫外檢測器進(jìn)行檢測，具有重現(xiàn)性好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。其中，高效液相色譜法發(fā)展迅速、應(yīng)用面廣，適用性遠(yuǎn)大于高效毛細(xì)管電泳法。雖然高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度，然而該方法的成本高、局限性較大，制約了其廣泛應(yīng)用。固相萃取法的應(yīng)用范圍廣，但存在步驟繁瑣、誤差大、重現(xiàn)性不高等問題[8]。該方法使用酸和堿分別沉淀樣品中的檢測干擾成分如蛋白質(zhì)和糖類等，采用高效液相色譜法測定核苷酸含量，相比于水解、固相萃取法測定更準(zhǔn)確，相對(duì)于質(zhì)譜法測定更簡便快捷，成本更低，重復(fù)性、適用性好，適于更廣泛的核苷酸測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent1200，Agilent公司）；離心機(jī)（Sigma 3k15）；天平（賽多利斯 0.01 mg）；pH計(jì)（奧立龍）；超純水系統(tǒng)（Milliber QS型，Milliber公司）。

1.2 材料試劑

腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100154）、胞嘧啶核苷一磷酸（CMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100067）、鳥嘌呤核苷一磷酸二鈉鹽（GMP.2Na）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100068）、尿嘧啶核苷一磷酸二鈉鹽（UMP.2Na）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100069）、次黃嘌呤核苷一磷酸二鈉鹽（IMP.2Na）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100181）、甲醇（色譜純）、乙酸（優(yōu)級(jí)純）、磷酸二氫鉀（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、奶粉樣品（市售）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于80℃干燥過夜，使用0.01mg天平重量法配制成1mg/g標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液。再使用精度為 0.01mg天平，用1mg/g標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成5種核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 奶粉樣品配制

用精度為0.1 mg天平稱量15 mL離心管質(zhì)量，然后稱量約0.5g奶粉樣品至該離心管中，加入50℃超純水約4g，充分震蕩混勻，平衡至室溫。用精度為0.1mg天平稱取核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到不同的奶液中，同時(shí)配制空白對(duì)照。

1.5 核苷酸的提取

往1.4配制的奶液中分別按體積分?jǐn)?shù)0.5%、1%、2%、3%、4%、5%比例加入冰乙酸溶液，震蕩混勻，放置20min。使用精度為0.1mg天平用重量法加超純水定容至10 g溶液，然后6000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管，用10mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)溶液的pH值至7～8之間，混勻后放置20min，6000r/min離心10 min。取上清液用0.22 μm濾膜過濾后，儲(chǔ)存于4℃冰箱待分析。

1.6 核苷酸高效液相色譜分離分析

采用耐水性的色譜柱，磷酸鹽做為流動(dòng)相，DAD檢測器，用保留時(shí)間進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行定量，對(duì)配方奶粉中的核苷酸進(jìn)行了定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種核苷酸液相色譜分離分析條件的優(yōu)化

用核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品，通過優(yōu)化色譜分離分析條件，完成了5種核苷酸高效液相色譜的有效分離分析。

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Ailent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測器為DAD檢測器；樣品濃度為1 mg/mL；進(jìn)樣體積為10 μL。檢測波長 AMP為 257 nm，CMP為 280 nm，UMP為262nm，IMP.2Na為249nm，GMP.2Na為254nm。

2.1.2 流動(dòng)相及梯度條件

流動(dòng)相由兩部分組成，分別為：

流動(dòng)相A：100mmol/L磷酸二氫鉀溶液，pH=5.6；

流動(dòng)相B：100mmol/L磷酸二氫鉀溶液，pH=5.6，20%（ν/ν）甲醇。

流動(dòng)相梯度變化見表1。

表1 奶粉中核苷酸含量測量色譜梯度洗脫條件

5種核苷酸相互之間達(dá)到了基線分離，峰型對(duì)稱性較好，各核苷酸之間不互為雜質(zhì)，分離分析結(jié)果見圖1。由圖1可以看出利用文中色譜分離條件可以較好地實(shí)現(xiàn)5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)的有效分離，滿足了定量測量的需要。

圖1 5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜分離分析

2.2 奶粉樣品中干擾組分的去除及5種核苷酸液相色譜分離分析

利用酸、堿沉淀和高速離心相結(jié)合的方法對(duì)奶粉中影響核苷酸檢測的其他組分進(jìn)行了有效去除研究?？疾炝瞬煌岫葘?duì)奶粉樣品中其他成分的去除情況，發(fā)現(xiàn)不同酸度處理樣品雜質(zhì)峰影響待測核苷酸的數(shù)量不同。酸沉淀后，調(diào)節(jié)溶液的pH至堿性，可以有效去除另外一些干擾組分，結(jié)果見表2。此外考察了不同的離心力對(duì)樣品干擾組分去除的情況，發(fā)現(xiàn)6000r/min以上的離心處理可以有效去除干擾組分，結(jié)果見圖2。

表2 乙酸濃度對(duì)檢測的影響

圖2 奶粉中5種核苷酸高效液相色譜分離分析

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

利用5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后配制核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及取0.5 g樣品各核苷酸的檢出限見表3。

表3 5種核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限

由表3的數(shù)據(jù)可以看出標(biāo)準(zhǔn)系列的線性較好，可以作為定量的依據(jù)。在線性范圍內(nèi)，配制合適的5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其信號(hào)強(qiáng)度為噪聲3倍時(shí)的核苷酸含量，作為方法的檢出限，5種核苷酸的方法檢出限均不大于0.15 μg/g，完全滿足測量的要求，可以對(duì)奶粉樣品中不同含量的核苷酸進(jìn)行定量測量。

2.4 方法的準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確性采用標(biāo)準(zhǔn)添加測定回收率實(shí)驗(yàn)，以不含上述5種核苷酸的奶粉樣品為本底，平行稱取7份，分別往其中加入5種核苷酸低濃度混標(biāo)和高濃度混標(biāo)，對(duì)上述7份樣品進(jìn)行前處理，平行測定3次，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表4。

表4 5種核苷酸加標(biāo)回收率結(jié)果（n=7）

表5 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度和重復(fù)性

表6 實(shí)驗(yàn)室室間精密度和再現(xiàn)性

表4數(shù)據(jù)表明，核苷酸加標(biāo)回收率在90.8%～99.3%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較好、可行性強(qiáng)、易于掌握。

2.5 方法的精密度、重復(fù)性和再現(xiàn)性

2.5.1 室內(nèi)精密度和重復(fù)性

在對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證的過程中，對(duì)奶粉等樣品中核苷酸含量進(jìn)行了測試。具體試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

分析表5數(shù)據(jù)可以看出，方法的室內(nèi)精密度和重復(fù)性限均較好，滿足了定量分析的要求。

2.5.2 室間精密度和再現(xiàn)性

選擇7家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間的驗(yàn)證。以不同的2個(gè)奶粉樣品為考察對(duì)象進(jìn)行測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6所示。

分析表6數(shù)據(jù)可以看出，方法的實(shí)驗(yàn)室間精密度和再現(xiàn)性限均較好，滿足了定量分析的要求，并且說明該方法的適用性較好。

3 結(jié)束語

研究建立了定量測定嬰幼兒奶粉中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黃嘌呤等5種核苷一磷酸的高效液相色譜方法，方法的測量精度較高，重復(fù)性較好，并且成本大大降低。方法的技術(shù)參數(shù)滿足了奶粉中核苷酸定量測量的需求，為奶粉中核苷酸含量的定量測量及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)提供了方法學(xué)依據(jù)。

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