李嬋娟

（保山中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，云南 保山675000）

石斛屬（Dendrobiu mSw.）是蘭科植物中的第二大屬，全球共有大約1000種，我國(guó)有74種2變種，主要分布在華南及西南地區(qū)，尤其以云南南部為多［1］。石斛是業(yè)內(nèi)外人士都熟知的常備藥品的必需原料，應(yīng)用于脈絡(luò)寧注射液、石斛夜光丸、通塞脈片、石斛散等數(shù)十種中成藥。脈絡(luò)寧制劑具有活血化瘀的功能，是利用石斛的“除痹”功效，筆者選擇簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快捷的小鼠凝血時(shí)間測(cè)定，膠原－腎上腺素致體內(nèi)血栓形成，觀察與比較幾種石斛粗提物的抗凝、抗血栓作用，初步評(píng)價(jià)其對(duì)心血管活性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

1.1.1 受試物 鼓槌石斛SHch（Dendrobiu m chr ysotoxu m），棕色浸膏，提取率3.15%；金釵石斛SHn（D.nobile），棕色浸膏，提取率5.42%；翅梗石斛SHtr（D.trigonopus），棕色浸膏，提取率4.34%；長(zhǎng)距石斛SHl（D.longicornum），棕色浸膏，提取率4.16%；報(bào)春石斛SHp（D.pri mulinu m），棕色浸膏，提取率13.81%；球花石斛SHth（D.thysif lor u m），棕色浸膏，提取率11.80%；玫瑰石斛SHcr（D.crepidatum），棕色浸膏，提取率121.11%；疊鞘石斛SHd（D.denneanum），棕色浸膏，提取率13.24%；黑毛石斛SHw（D.williamsonii），棕色浸膏，提取率11.39%；流蘇石斛SHf（D.f i mbriatu m），棕色浸膏，提取率14.27%；由中科院昆明植物研究所提供。所有樣品均為60%乙醇提取物，易吸濕，常溫密閉保存。

1.1.2 對(duì)照藥品 阿斯匹林腸溶片（拜阿斯匹靈，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào) H20050059，100 mg／片，Bayer Healt h Care AG 生產(chǎn)，批號(hào)BTA6ZB7）。

1.1.3 配制方法 各種石斛粗提物按提取率折算成6.0 g／kg的生藥劑量為實(shí)驗(yàn)的給藥劑量，臨用前稱(chēng)取適量樣品于乳缽中，用1%CMC－Na研磨后配制成相當(dāng)于生藥0.30 g／mL濃度的混懸液供小鼠灌胃用；陽(yáng)性對(duì)照阿斯匹林的配制方法同石斛粗提物。為保證受試物的穩(wěn)定性，所有樣品均為臨用前新鮮配制。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，全雄，體重18～24 g，購(gòu)自于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)：SCXK（滇）2005－0008。

1.3 主要儀器 AL104電子分析天平（稱(chēng)量試劑、藥品、臟器），梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；JJ2000型電子天平（稱(chēng)量動(dòng)物體重），常熟雙杰測(cè)試儀器廠；Millipore超純水處理系統(tǒng)，美國(guó) Millipore公司；BCD－225E冰箱，青島海爾冰箱廠。

1.4 主要試劑 膠原蛋白，美國(guó)Worthington生化集團(tuán)，批號(hào)35E8048－B；鹽酸腎上腺素注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字 H41021054，1 mg／mL，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號(hào)0909102；溴代苯，分析純，中國(guó)青浦合成試劑廠出品，批號(hào)20000405；橄攬油，化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司出品，批號(hào)20090801。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（－x±s）表示，用DAS ver1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用t′檢驗(yàn)；偏態(tài)分布資料用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間的影響 選用18～20 g雄性昆明種小鼠132只，按體重隨機(jī)分為12組：空白對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林40 mg／kg組；10種石斛樣品粗提物6.0 g／kg組；每組11只。各組動(dòng)物每日分別按6.0 g／kg干燥藥材劑量灌胃給藥1次，連續(xù)3 d，空白對(duì)照組灌服等容量1%CMC－Na 20 mL／kg.bw。末次給藥后1 h，用20 u L采血管于每鼠眼后靜脈叢取血，以毛細(xì)管法測(cè)定凝血時(shí)間［2］。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：除翅梗石斛外，所有給藥組均能不同程度延長(zhǎng)小鼠全血的凝血時(shí)間；其中，陽(yáng)性對(duì)照阿斯匹林、鼓槌石斛、金釵石斛、長(zhǎng)距石斛、球花石斛、玫瑰石斛、疊鞘石斛、黑毛石斛、流蘇石斛分別延長(zhǎng)30.58、79.45、33.52、54.44、86.56、59.92、49.70、66.62、39.73%，與空白對(duì)照組相比差異顯著，報(bào)春石斛有一定延長(zhǎng)趨勢(shì)。

表1 石斛樣品粗提物對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間的影響

2.2 對(duì)膠原－腎上腺素誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)血栓形成的影響［3］選20～22 g雄性昆明種小鼠132只，按體重隨機(jī)分為12組：空白對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林40 mg／kg組；10種石斛樣品粗提物6.0 g／kg組；每組11只。各組動(dòng)物每日分別按劑量灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d，空白對(duì)照組灌服等容量1%CMCNa 20 mL／kg.bw。末次給藥后30 min，每鼠尾靜脈注射由膠原蛋白－腎上腺素組成的混合誘導(dǎo)劑溶液0.1 mL／10 g.bw，觀察15 min內(nèi)小鼠的偏癱、恢復(fù)及死亡情況。球花石斛和黑毛石斛組各有1只動(dòng)物因注射誘導(dǎo)劑失誤（未進(jìn)入血管），從實(shí)驗(yàn)中剔除。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：除報(bào)春石斛和翅梗石斛外，所有給藥組和陽(yáng)性對(duì)照阿斯匹林組，均能顯著對(duì)抗膠原－腎上腺素誘導(dǎo)小鼠的體內(nèi)血栓形成，使動(dòng)物死亡率明顯降低；報(bào)春石斛和翅梗石斛僅有一定作用趨勢(shì)。

表2 石斛樣品粗提物對(duì)小鼠體內(nèi)血栓形成的影響

3 討論

血栓形成是一個(gè)復(fù)雜的生理、生化及病理過(guò)程，是心腦血管病發(fā)病的重要因素，它能引起動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦病等。目前，對(duì)于血栓形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍是以德國(guó)病理學(xué)家Virchow提出的三聯(lián)制為基礎(chǔ)，即血管壁損傷、血液成分改變、血流異常及其相互作用［4］。當(dāng)血管壁損傷，凝血活性增高，血小板粘附、聚集性增高，血流緩慢、血液粘度增高時(shí)，就容易形成血栓。

凝血過(guò)程是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜過(guò)程，既可由血管內(nèi)膜損傷激活的“內(nèi)源途徑”引發(fā)，也可由血管外的凝血因子與血液接觸而啟動(dòng)的“外源途徑”引發(fā)。在正常情況下，體內(nèi)凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，從而保證了血液有潛在的可凝固性和持續(xù)的流動(dòng)性。缺血性心腦血管病的病理生理過(guò)程中存在著凝血—纖溶的異常變化。本研究結(jié)果表明，6 g／kg干燥藥材的鼓槌石斛、金釵石斛、長(zhǎng)距石斛、球花石斛、玫瑰石斛、疊鞘石斛、黑毛石斛、流蘇石斛粗提物經(jīng)口連續(xù)給藥3 d，均能明顯延長(zhǎng)小鼠全血的凝血時(shí)間，提示抗凝血作用顯著；報(bào)春石斛僅有一定延長(zhǎng)趨勢(shì)。

膠原－腎上腺素致血瘀模型是中醫(yī)學(xué)上常用的致血小板聚集血栓栓塞模型。膠原可以激活血小板膜上磷脂酶A2，加速磷脂水解釋放花生四烯酸；花生四烯酸在環(huán)氧酶以及進(jìn)一步血栓烷A2合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為血栓素A2（TXA2），促進(jìn)循環(huán)血流中的血小板發(fā)生聚集。腎上腺素兼有α和β受體的激動(dòng)作用，對(duì)α受體的激動(dòng)可引起皮膚、黏膜、內(nèi)臟血管收縮，尤其是對(duì)肺部血管的收縮，加重了呼吸障礙，利于肺與腦血栓的形成；對(duì)β受體的激動(dòng)可引起骨骼肌和心肌興奮、心率加快等作用，故膠原和腎上腺素合用具有增強(qiáng)致血小板聚集的協(xié)同作用。給小鼠尾靜脈注射膠原－腎上腺素可誘發(fā)血栓性偏癱和死亡，6 g／kg干燥藥材的鼓槌石斛、金釵石斛、長(zhǎng)距石斛、球花石斛、玫瑰石斛、疊鞘石斛、黑毛石斛、流蘇石斛粗提物經(jīng)口連續(xù)給藥5 d，均能顯著對(duì)抗膠原－腎上腺素誘導(dǎo)小鼠的體內(nèi)血栓形成，使動(dòng)物死亡率明顯降低，提示抗血栓作用顯著。

［1］李旻，劉友平，張玲，等 .石斛屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（5）：73.

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.第一版 .北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：484～485.

［3］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.第一版 .北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：579～580.

［4］王莉莉.2，6－二甲基－4－（3－硝基苯基）－1，4－二氫－3，5－吡啶二羧酸－3－甲酯－5－正戊酯（MN9202）抗實(shí)驗(yàn)性血栓形成作用［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33（5）：284.