李旺林， 曹 杰， 張偉健， 楊 平， 鐘俊斌， 楊建榮， 張 通

(廣州醫(yī)學院附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180)

有研究報道，巴西鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)感染導致腸道E－cadherin的表達改變，導致小腸上皮細胞的附著力損失［1］;而多形螺旋線蟲(Heligmosomoides polygyrus)感染導致小腸上皮通透性增加［2］。但腸道蠕蟲感染及其誘導的Th2反應對結(jié)腸上皮通透性影響的相關(guān)研究較少見。目前還不清楚蠕蟲感染是否可引起結(jié)腸上皮通透性改變和如何影響結(jié)腸上皮通透性。本文旨在觀察旋毛蟲對腸道黏膜通透性影響，并初步探討其機制。

材料和方法

1 動物及分組

選擇6到8周大的雌性BALB/c小鼠(SPF級)，以高壓蒸汽消毒的食物和水喂養(yǎng)。將BALB/c鼠隨機分為2組，即T．spiralis感染組(BALB/c+T．s組)和無T．spiralis感染組(對照組，BALB/c組)。每只小鼠經(jīng)口服喂養(yǎng)T．spiralis幼蟲400條(幼蟲配成懸液喂養(yǎng)，并以顯微鏡鑒定為活蟲)。

2 結(jié)腸通透性的分析

小鼠感染T．spiralis7 d后，直腸內(nèi)給予辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP;Sigma)，然后測量血液中HRP濃度判定結(jié)腸通透性。在小鼠禁食12 h之后，以2%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，50μL辣根過氧化物酶(含0．6 mg)以針頭經(jīng)直腸注入。辣根過氧化物酶灌注后的0(即為未灌注HRP的時點)、60和120 min后，從尾靜脈收集血液樣本，采用ELISA法測定血清辣根過氧化物酶濃度。

3 血清IgG1和IgG2a的檢測

將上述尾靜脈收集的血液樣本，以ELISA法檢測IgG1和IgG2a的表達量。

4 淋巴細胞細胞因子ELISA檢測

T．spiralis感染7 d后，處死小鼠。所有小鼠經(jīng)斷頸法處死。打開腹腔，取出腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，MLN)。將外周淋巴結(jié)分組研磨(溶液為cDMEM)，用70μm的濾器過濾，4℃、1 500 r/min離心8 min，棄除上清，加入2 mL cDMEM溶液，將細胞振蕩溶解，將之調(diào)成5×109/L。加CD3單克隆抗體孵育，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)液上清，置于－20℃凍存。以ELISA法檢測Th2細胞因子白細胞介素4(interleukin－4，IL－4)的表達量。

5 信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)基因敲除小鼠實驗

選6～8周雌性基因敲除小鼠(SPF級，BALB/c背景，購于美國杰克森實驗室)。將小鼠分為3組，STAT6敲除小鼠組(無 T．spiralis感染，STAT6組)、BALB/c小鼠感染組(BALB/c+T．s組)和STAT6敲除小鼠感染組(STAT6+T．s組)，T．spiralis感染小鼠7 d后，先行尾靜脈取血1次(在實驗結(jié)果中標示為0 min)，然后以HRP經(jīng)直腸注入，辣根過氧化物酶灌注后60和120 min后，從尾靜脈收集血液樣本，采用ELISA法測定血清辣根過氧化物酶濃度，以此來判定結(jié)腸上皮通透性。處死小鼠，取出腸系膜淋巴結(jié)，制作淋巴細胞懸液，加CD3單克隆抗體孵育72 h。收集上清，ELISA法檢測細胞因子的變化。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，采用Graph-Pad Prism統(tǒng)計學軟件處理，進行t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 T．spiralis感染導致結(jié)腸上皮通透性變化

對照組小鼠血清的辣根過氧化物酶量很少。蠕蟲感染的小鼠血清辣根過氧化物酶水平顯著增高(HRP處理60 min后)。結(jié)果表明腸道寄生蟲感染后結(jié)腸上皮通透性顯著增加，見圖1。

Figure 1．Serum HRP concentration at different time points in BALB/c mice infected with Trichinella spiralis(T．s)．BALB/c mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖1 不同時點血清HRP濃度

2 血清IgG1和IgG2a的檢測結(jié)果

與無感染組比較，T．s感染組IgG1表達明顯增高，IgG2a表達明顯降低，見圖2。

Figure 2．Serum IgG1 and IgG2a．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，blood was collected by mice tail vein．Serum IgG1 and IgG2a were detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖2 各組血清IgG1和IgG2a檢測結(jié)果

3 腸系膜淋巴結(jié)細胞因子ELISA檢測結(jié)果

加CD3單克隆抗體刺激，無感染組IL－4(21．0±2．3) μg/L，感染組 IL －4(193．0 ±12．5)μg/L，感染組IL－4的表達明顯增高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05)，見圖3。

Figure 3．IL－4 production of MLN in BALB/c and BALB/c+T．s mice．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL －4 production of MLN was detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．圖3 腸系膜淋巴結(jié)IL－4的表達

4 STAT6敲除小鼠蠕蟲感染不能改變結(jié)腸上皮通透性

BALB/c小鼠感染后血清辣根過氧化物酶水平顯著增加，有蠕蟲感染和無感染的STAT6敲除小鼠血清辣根過氧化物酶量無顯著差異，見圖4。

Figure 4．Serum HRPconcentration in STAT6 knockout mice experiment．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．ˉx±s．n=5．*P＜0．05 vs STAT6+T．s or STAT6．圖4 STAT6敲除小鼠結(jié)腸組織HRP含量

5 STAT6敲除小鼠腸系膜淋巴結(jié)IL－4的變化

加CD3單克隆抗體刺激，BALB/c+T．s組IL－4(193．0 ±12．5)μg/L，STAT6+T．s組 IL －4(15．0±3．1)μg/L，STAT6 組 IL －4(3．0 ±1．2) μg/L，BALB/c+T．s組與 STAT6+T．s組 IL－4表達量比較，BALB/c+T．s組表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05)，見圖5。

Figure 5．IL － 4 production of MLN in STAT6 knockout mice．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL－4 production of MLN was detected by ELISA．ˉx±s．n=5．*P ＜0．05 vs STAT6+T．s．圖5 STAT6敲除小鼠結(jié)腸組織中IL－4含量

討 論

我們的結(jié)果表明，在野生型BALB/c小鼠中，小腸T．spiralis感染能夠?qū)е陆Y(jié)腸上皮通透性增加，但在Th2缺陷的STAT6－/－小鼠中沒有出現(xiàn)這種情況。這些結(jié)果表明，機制之一可能是旋毛蟲感染影響了STAT6信號通路，從而改變結(jié)腸上皮屏障功能。

大分子HRP標記探針技術(shù)已廣泛用于測量腸上皮細胞運輸能力［3］。通常情況下，腸腔可溶性抗原通過以下2條路線進行轉(zhuǎn)運:經(jīng)細胞途徑或通過細胞間途徑。經(jīng)細胞的通透性對大分子通過上皮細胞的轉(zhuǎn)運是一個重要的途徑，有助于調(diào)節(jié)免疫激活。有研究顯示，腸道蠕蟲感染增加了腸道細菌易位和細菌脂多糖吸收加入門靜脈循環(huán)，從而改變屏障功能［4］，IL－4通過改變細胞間黏附分子明顯增強了高分子通透性［5］。

T．spiralis主要寄生在腸道小腸，而我們觀察的是結(jié)腸上皮屏障功能的影響。因此，結(jié)腸上皮屏障功能改變與旋毛蟲直接導致的機械性損傷無關(guān)。在本研究中，我們用Th2缺陷STAT6敲除小鼠測試小腸蠕蟲是否通過蠕蟲引起的自適應免疫激活間接影響結(jié)腸上皮屏障功能。我們結(jié)果表明，在BALB/c鼠中，旋毛蟲感染導致了小鼠結(jié)腸上皮通透性增加，但是在Th2缺陷STAT6敲除小鼠中，T．spiralis感染卻沒有出現(xiàn)這種情況，小鼠結(jié)腸通透性并沒有因T．spiralis感染而增加。這些結(jié)果充分表明淋巴細胞活化、尤其是Th2細胞的活化，在腸道蠕蟲感染中改變了腸道屏障作用。

Th2細胞因子IL－4和IL－13能夠通過STAT6或磷酸肌醇3－激酶(PI3K)途徑影響它們靶細胞的激活。此前，Ceponis等［6］使用T84細胞(人類結(jié)腸上皮細胞模型)研究IL－4和IL－13參與調(diào)節(jié)上皮通透性信號轉(zhuǎn)導通路，認為PI3K是IL－4和IL－13調(diào)節(jié)跨上皮電阻(TER)的主要近端信號途徑。但是，最近的研究表明，Th2(IL－13)依賴的屏障調(diào)控并不需要PI3K參與，但可能涉及STAT6，IL－13作為STAT6的抑制劑，不能抑制PI3K，但能避免IL－13誘導的 TER損失［7］。我們研究顯示，T．spiralis感染在STAT6敲除小鼠中未能改變結(jié)腸上皮通透性，這個結(jié)果支持了蠕蟲感染時STAT6在調(diào)節(jié)過程中的腸上皮屏障功能的作用。這些結(jié)果進一步提示STAT6信號通路和Th2免疫反應在調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障中的作用。

總之，我們的研究表明，蠕蟲感染能導致結(jié)腸上皮完整性和腸道上皮屏障功能的改變，而在其中一個潛在的機制可能是蠕蟲感染誘導的腸道黏膜上淋巴細胞誘導產(chǎn)生的Th2反應參與造成的。以前研究均提示［8－10］，蠕蟲感染中腸道黏膜免疫反應的調(diào)節(jié)涉及多種作用機制，包括先天性和適應性免疫系統(tǒng)效應細胞的調(diào)節(jié)。對蠕蟲免疫調(diào)節(jié)作用機制更深一步的了解，不僅將為免疫介導的疾病建立新穎和更有效的治療方法，而且還能為慢性腸道蠕蟲感染嚴重地區(qū)的微生物疾病預防和治療設(shè)計有效腸道疫苗。

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