葉劍榮 袁利群 龍湘黨 諶兵來(lái)

1.湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410005；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 201203

HSP基因診斷平臺(tái)的建立和新的HSP致病基因定位的初步研究

葉劍榮1袁利群1龍湘黨1諶兵來(lái)2

1.湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410005；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 201203

目的探討我國(guó)各地HSP家系先證者及成員的基本情況，并定位新的HSP致病基因以便于為我國(guó)HSP基因診斷平臺(tái)的建立提供依據(jù)。方法收集我國(guó)遺傳病資源管理中心的80例HSP家系先證者和成員為研究對(duì)象，抽取靜脈抗凝血液實(shí)施基因提取并進(jìn)行研究。結(jié)果HSP患者中男性比例較高，單純型HSP患者比例較高，首發(fā)癥狀中以下肢肌張力升高所占比例最高，為100%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。單純型HSP患者的基因SPG4、SPG3A突變頻率明顯高于復(fù)雜型，SPG6突變頻率明顯低于復(fù)雜型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。對(duì)患者致病基因相關(guān)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)LOD值比較，結(jié)果輸入U(xiǎn)CSC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示相應(yīng)區(qū)間屬于19號(hào)染色體，位于著絲點(diǎn)附近。結(jié)論SPG4、SPG3A在臨床診斷單純型HSP患者具有較好的指示作用，SPG6在診斷復(fù)雜型HSP患者時(shí)具有較好的指示作用；新的HSP致病基因亞型在19號(hào)染色體著絲粒附近的P12-Q12區(qū)域。

HSP基因；診斷平臺(tái)；致病基因定位；初步研究

HSP又名家族性Strumpell-Lorrain痙攣性截癱[1]，屬于因皮質(zhì)脊髓束損傷而造成的具有遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)退行性疾病，患者臨床表現(xiàn)為下肢肌張力升高、脊柱側(cè)彎、腱反射亢進(jìn)、進(jìn)行性痙攣步態(tài)、髕踝陣攣等，一些患者可能還伴智力障礙、視神經(jīng)萎縮、白內(nèi)障、小腦性共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)性耳聾、錐體外系癥狀、腦白質(zhì)病變、腦萎縮等其他類型神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[2-3]，不僅影響患者自身的日常生活和自理，同時(shí)影響家庭生活與和諧，增加生活負(fù)擔(dān)。本研究選取2010年4月～2012年3月間我國(guó)各地HSP家系先證者和成員進(jìn)行相關(guān)研究，探討我國(guó)各地HSP家系先證者及成員的基本情況，并定位新的HSP致病基因以便于為我國(guó)HSP基因診斷平臺(tái)的建立提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我國(guó)遺傳病資源管理中心的80例HSP家系先證者和成員為研究對(duì)象，其中男55例，女25例；年齡12～44歲，平均（25.8±2.3）歲；病程2～28年，平均（15.8±8.2）年；籍貫包括吉林、山東、河北、湖北、湖南、江蘇、江西、廣東等。另選取健康人群100例作為對(duì)照，其中男68例，女32例，年齡10～47歲，平均（26.6±3.5）歲；健康受試者性別、年齡、籍貫與HSP家系先證者和成員差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有受試者均經(jīng)由甲狀腺、腎上腺、肝腎功能檢測(cè)，并行血清B12檢測(cè)、CT或MRI掃描，患者均無(wú)原發(fā)性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和B12缺乏等。所有患者及受試家系成員均知情并簽署同意書。

1.2 方法

所有受試HSP家系先證者和成員均抽取靜脈抗凝血液5～10mL，并應(yīng)用酚/氯仿法提取DNA。采用加拿大提供的Primer3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，完成對(duì)序列的設(shè)計(jì)。進(jìn)行PCR反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，電泳后行固定、染色和顯色。獲得所需大小的片段后，以核酸外切酶和蝦堿性磷酸酶將片段置于冰上處理，試劑包括：SAP 0.8μL，ddH2O 0.75μL，ExonucleaseⅠ0.25μL，SAPbuffer 0.2μL和PCR片段8μL。經(jīng)室溫孵育90 min后，于80℃環(huán)境下滅活核酸外切酶和蝦堿性磷酸酶15min，采用ABIprism3730儀器進(jìn)行測(cè)序，再應(yīng)用Dnastar軟件進(jìn)行序列分析。分別通過(guò)單核苷酸多態(tài)性（SNP）國(guó)際聯(lián)合會(huì)（TSC）、美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)查詢以排除堿基序列變異中已知的基因多態(tài)，將剩余未知基因進(jìn)行疾病表型分離，再與同時(shí)檢測(cè)的100例健康人的基因進(jìn)行相同位點(diǎn)的堿基比照，獲得基因的致病突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP家系先證者和成員基本資料比較

HSP患者中男性比例較高，單純型HSP患者比例較高，首發(fā)癥狀中以下肢肌張力升高所占比例最高，為100.00%，其次是下肢腱反射亢進(jìn)，組內(nèi)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 HSP家系先證者和成員基本資料比較

2.2 不同HSP分型患者基因突變頻率比較

單純型HSP患者的基因SPG4、SPG3A突變頻率明顯高于復(fù)雜型，SPG6突變頻率明顯低于復(fù)雜型，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較具有顯著差異（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同HSP分型患者基因突變頻率比較[n（%）]

2.3 HSP患者致病基因和相關(guān)SNP位點(diǎn)LOD值比較

對(duì)患者致病基因相關(guān)SNP位點(diǎn)LOD值比較結(jié)果輸入U(xiǎn)CSC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示相應(yīng)區(qū)間屬于19號(hào)染色體，位于著絲點(diǎn)附近。見(jiàn)表3。

表3 HSP患者致病基因和相關(guān)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的LOD值比較

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)水平的提高，分子遺傳學(xué)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前部分HSP致病基因已經(jīng)實(shí)現(xiàn)克隆，給臨床的相關(guān)研究提供了基于基因診斷水平的諸多依據(jù)[4]。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，HSP可劃分為單純型病變和復(fù)雜型病變：?jiǎn)渭冃偷呐R床主要表現(xiàn)為下肢肌張力升高、脊柱側(cè)彎、腱反射亢進(jìn)、進(jìn)行性痙攣步態(tài)、髕踝陣攣等不良癥狀；復(fù)雜型則同時(shí)伴有其他類型神經(jīng)系統(tǒng)的病變征狀，比如智力障礙、視神經(jīng)萎縮、白內(nèi)障、小腦性共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)性耳聾、錐體外系癥狀、腦白質(zhì)病變、腦萎縮等[5]。單純性患者在臨床的比例較多，在本研究中占77.5%，明顯高于復(fù)雜型（P＜0.05）。而對(duì)基因突變率研究顯示，單純型和復(fù)雜型HSP的SPG4、SPG3A、SPG6基因突變頻率明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SPG4、SPG3A在臨床診斷單純型HSP患者具有較好的指示作用，SPG6在診斷復(fù)雜型HSP患者時(shí)具有較好的指示作用。當(dāng)然，無(wú)論是單純型還是復(fù)雜型患者SPG基因的突變都僅是一部分，相比較而言，單純型患者SPG基因突變頻率明顯高于復(fù)雜型患者（P＜0.05），提示SPG基因的相關(guān)檢測(cè)對(duì)于診斷單純型HSP患者具有更好的臨床效果，以便于為研究治療方案提供一定的依據(jù)。

對(duì)患者基因位點(diǎn)的研究結(jié)果顯示HSP致病基因出現(xiàn)在19號(hào)染色體上，且位于絲粒附近P12-Q12區(qū)域，一些外國(guó)文獻(xiàn)曾報(bào)道類似病例[6-7]，結(jié)果顯示患者致病基因位于19號(hào)染色體上D19S220-D19S420和D19S416-D19S220區(qū)間，屬于SPG12亞型，而本組研究結(jié)果的P12-Q12區(qū)間，不在之前的研究結(jié)果范圍之內(nèi)，提示非SPG12亞型，具有特異性，可認(rèn)為是新的HSP致病基因亞型，可作為建立HSP基因診斷平臺(tái)的新資源，從而擴(kuò)大和完善整個(gè)診斷平臺(tái)的建設(shè)。當(dāng)然，在隨后的相關(guān)工作中，還需要進(jìn)一步通過(guò)對(duì)各類基因克隆策略的研究來(lái)爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)對(duì)HSP致病基因的克隆，從而為臨床治療提供更好的解決方案[8]。

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Prelim inary study of the establishment of HSP genes of diagnostic platform and the assignment of HSP virulence gene

YE Jianrong1 YUAN Liqun1 LONG Xiangdang1 CHEN Binglai2
1.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Hu'nan Province,Hu'nan Province,Changsha 410005,China;
2.Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

ObjectiveTo investigate the basic situation of the proband and members of the HSP family all over our country,and to position the new HSP genes that cause the disease to provide data for facilitating the establishment of the HSP genetic diagnostic platform.Methods80 cases of proband and members of HSP family were collected from genetic disease resourcesmanagement center,the geneswere extracted and studied from intravenous anticoagulant blood.ResultsPercentage ofmale HSP patientswas found higher,percentage of simple HSP was found higher,the highest percentage of the initial symptom was the increasing tension of lower limbmuscle,the differenceswere all statistically significant(all P＜0.05). Mutation frequencies of SPG4 and SPG3A gene in simple type genes of patientswith HSPwere found higher than those in complicated type,mutation frequency of SPG6 gene in simple type gene of patientswith HSPwas found higher than that in complicated type,the differences were all statistically significant(all P＜0.05).LOD values of related SNP points were compared in pathogenic patients,the results were entered the UCSC database for analysis,the corresponding interval was found belonged to chromosome 19 according to the results,and located near the centromere.ConclusionSPG4 and SPG3A have a better indicating effect in clinical diagnosing in simple HSP patients,SPG6 has a better indicating effect in the diagnosis of patients with complicated HSP;new HSP of subtype locate in P12-Q12 region around the centromere of chromosome 19.

HSP gene;Diagnostic platform;Causative gene positioning;Preliminary study

R744

A

1673-7210（2012）11（b）-0036-03

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：B2009071）。

葉劍榮（1963-），男，副主任檢驗(yàn)師，主要從事免疫、基因診斷工作。

2012-06-07 本文編輯：李繼翔）