王杜平， 張 穎， 王慶一

(1.珠海市婦幼保健院 婦一科,廣東 珠海 519000； 2.珠海市婦幼保健院 病理科,廣東 珠海 519000)

早期子宮頸鱗癌中podoplanin標記的淋巴管密度及其臨床意義

王杜平1， 張 穎2， 王慶一1

(1.珠海市婦幼保健院 婦一科,廣東 珠海 519000； 2.珠海市婦幼保健院 病理科,廣東 珠海 519000)

目的探討早期子宮頸癌組織中腎小球上皮細胞整合膜蛋白(podoplanin)標記的淋巴管密度(LVD)及其臨床意義。方法免疫組化SP法檢測38例Ⅰb1期子宮頸鱗狀細胞癌和10例非癌性宮頸組織中podoplanin標記的LVD，分析其與臨床病理分級的關(guān)系。結(jié)果癌組織中心及邊緣組織淋巴管密度與正常子宮頸組織相比均明顯增加(P<0.05，P<0.05)；癌灶邊緣組織淋巴管密度為12.10±2.83條/例，明顯高于癌灶中心部位淋巴管密度7.71±1.12條/例(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌灶邊緣組織LVD 14.67±3.72條/例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10.77±2.65條/例，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；組織學分級G1、G2和G3組癌灶邊緣LVD分別為8.29±1.76條/例，11.31±3.63條/例，13.24±0.79條/例。G2組LVD明顯高于G1組而低于G3組(P<0.05，P<0.05)。結(jié)論早期宮頸癌組織中LVD的增加有臨床意義，其與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，細胞分化等臨床病理因素相關(guān)，宮頸癌組織中淋巴管的生成可能在其淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

宮頸癌；淋巴轉(zhuǎn)移；腎小球上皮細胞整合膜蛋白

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一, 其死亡率是發(fā)展中國家女性惡性腫瘤的首位。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的復雜過程,常常涉及到腫瘤間質(zhì)細胞的改變，特別是間質(zhì)內(nèi)微血管和微淋巴管的變化。惡性腫瘤臨床進展的關(guān)鍵是獲得轉(zhuǎn)移潛能，人類大多數(shù)的惡性腫瘤具有通過淋巴轉(zhuǎn)移的特性。宮頸癌主要通過直接蔓延和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩種方式轉(zhuǎn)移，通過血行轉(zhuǎn)移者較少見，腫瘤是否已經(jīng)播散到區(qū)域淋巴結(jié)對患者的預(yù)后至

關(guān)重要，可直接影響治療方案的制定。隨著淋巴管內(nèi)皮細胞分離技術(shù)的改進和一些特異淋巴管內(nèi)皮標志物的發(fā)現(xiàn)，腫瘤淋巴管生成的研究有了可靠的工具。目前常用的淋巴管內(nèi)皮標志物有Podoplanin, Prox1，淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1和血管內(nèi)皮生長因子受體-3等。其中Podoplanin被認為是較理想的淋巴管內(nèi)皮標志物[1].本實驗采用免疫組化法檢測早期子宮頸癌組織中腎小球上皮細胞整合膜蛋白(podoplanin)的表達，通過其標記的淋巴管密度的比較, 分析其與宮頸癌臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇珠海市婦幼保健院婦科2009年1月至2010年6月期間手術(shù)切除的宮頸癌組織38例存檔蠟塊為研究對象，按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標準，其臨床分期均為Ⅰ b1期；組織學類型均為鱗狀細胞癌；組織學分級：G1 18例，G2 11例，G3 9例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例；患者年齡26～70歲，中位年齡42歲。另選其他因良性疾病切除子宮得到的非癌性宮頸組織10例為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗試劑 采用免疫組化SP法標記淋巴管，兔抗人Podoplanin多克隆抗體工作濃度為1∶50，SP 試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 實驗方法 組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，分別進行蘇木素-伊紅染色，Podoplanin免疫組化染色，每批切片均設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照為已知陽性的大腸癌組織切片，PBS代替一抗作為陰性對照，操作步驟按產(chǎn)品說明書進行。

1.2.3 結(jié)果判定 參照Weidner等[2]的報道統(tǒng)計LVD。陽性淋巴管判定標準：有明顯管腔和棕黃色內(nèi)皮細胞形成的條狀、隙狀孤立或簇狀結(jié)構(gòu)。在低倍鏡下尋找癌灶內(nèi)部和癌灶邊緣組織陽性淋巴管密集區(qū)域，高倍鏡下觀察并計數(shù)，淋巴管密度以5個高倍鏡視野中陽性淋巴管的平均數(shù)表示。腫瘤組織內(nèi)部淋巴管密度定義為腫瘤中心組織實質(zhì)內(nèi)LVD，腫瘤邊緣淋巴管密度定義為腫瘤組織實質(zhì)周圍5 mm以內(nèi)的LVD。正常子宮頸組織淋巴管密度定義為基底膜下2 mm以內(nèi)間質(zhì)內(nèi)的LVD。

1.3 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行。兩組之間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組之間均數(shù)的比較用單向方差分析。P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌組織中淋巴管形態(tài)學特點及podoplanin標記的LVD比較(見表1) 正常宮頸組織中淋巴管形態(tài)規(guī)則，呈開放狀態(tài)，光鏡下呈棕黃色染色，管壁較薄的單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成，細胞核大且向管腔內(nèi)突出，與血管明顯不同。子宮頸癌組織中淋巴管主要分布在腫瘤周邊組織，且管腔擴大，形態(tài)不規(guī)則。癌灶中心部位淋巴管管腔小，多為閉塞狀態(tài)，呈條狀、孤立或簇狀結(jié)構(gòu)。宮頸癌灶中心LVD為7.71±1.12，癌灶邊緣LVD為12.10±2.83，對照組LVD為2.01±0.26，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。

表1癌灶中心組織及邊緣組織podoplanin標記的淋巴管密度比較

例數(shù)(n)LVD(條/例)對照組102.01±0.26癌灶中心組織387.71±1.12*癌灶邊緣組織3812.10±2.83*△

注：*與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義P<0.05，△與中心組織組相比，差異有統(tǒng)計學意義P<0.05

2.2 子宮頸癌淋巴管密度與臨床病理因素的關(guān)系(見表2) 盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組，癌灶邊緣LVD為14.67±3.72，與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(10.77±2.65)相比明顯增加(P<0.01)。組織學分級G1、G2和G3其癌灶邊緣LVD分別為8.29±1.76，11.31±3.63，13.24±0.79。與G1組相比，G2組癌灶邊緣LVD明顯增加(P<0.05，)，而和G3組相比，其LVD明顯減少，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2宮頸鱗癌臨床病理特征與podoplanin標記的淋巴管密度的關(guān)系

nLVD組織學分級G1188.29±1.76G21111.31±3.63*G3913.24±0.79△淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性2610.77±2.65陽性1214.67±3.72△△

注：G2組與G1組相比，*P<0.05，G3組與G1組相比，△P<0.05，與淋巴轉(zhuǎn)移陰性組相比，△△P<0.01

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一大特征,也是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，臨床及病理研究發(fā)現(xiàn)，當實體腫瘤長到一定程度時，需要新生血管的形成，為腫瘤內(nèi)部的細胞提供營養(yǎng)，促進腫瘤組織進一步生長，并為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供血行通道。對腫瘤微脈管系統(tǒng)的生成及其與腫瘤生物學行為的研究一直倍受關(guān)注。對腫瘤血管生成的研究起步較早，并且取得了很多成果。但大部分惡性腫瘤最初的轉(zhuǎn)移并不是通過血管，而是通過淋巴道，淋巴管生成的分子機制近年來成為研究癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移的熱點。研究表明腫瘤細胞通過淋巴管生成調(diào)控因子的表達誘導淋巴管生成，并且可促進腫瘤細胞的淋巴道轉(zhuǎn)移。新生的毛細血管與毛細淋巴管在許多方面有相似之處，普通的染色技術(shù)很難將它們分辨開來。但隨著一系列淋巴管內(nèi)皮細胞標記物的發(fā)現(xiàn),如VEGF-C、VEGF-D、 LYVE-1、Prox1和Podoplanin等，微血管和微淋巴管的鑒別得到初步解決。

Podoplanin最初發(fā)現(xiàn)于腎小球足突內(nèi)皮表面，繼而發(fā)現(xiàn)其存在于成骨細胞膜、骨細胞膜、肺泡Ⅱ上皮細胞膜、淋巴管內(nèi)皮細胞上。其是細胞膜上的一種糖蛋白分子，一般以二聚體形式存在。Podoplanin的表達與淋巴管管徑大小有關(guān)，由單層內(nèi)皮構(gòu)成的毛細淋巴管表達最顯著，在淋巴結(jié)部位Podoplanin表達于淋巴門處小淋巴管和淋巴竇內(nèi)皮，不表達于大淋巴管和高度內(nèi)皮化靜脈，是一種可靠的淋巴管標記物[3]。

Podoplanin已被證實在不同惡性腫瘤組織中出現(xiàn)高表達，并與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。Wicki[4]等研究表明Podoplanin通過誘導細胞絲狀偽足形成促進細胞極化，增加細胞侵襲性，并增加腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)粘附，從而使腫瘤細胞發(fā)生侵襲，擴散，但其不引起內(nèi)皮間質(zhì)化，作用機制不詳。Schoppmann等[5]用抗podoplanin抗體及抗CD 34抗體對45例浸潤性乳腺癌標本的微淋巴管及微血管行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)微淋巴管的水平增高及淋巴管受腫瘤侵犯與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

腫瘤細胞產(chǎn)生淋巴管生成因子如VEGF-C，在淋巴生成因子的調(diào)控下，腫瘤組織淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，并形成管腔,生成新的淋巴管。腫瘤組織中新生的腫瘤淋巴管與生理狀態(tài)下的淋巴管結(jié)構(gòu)相似，但管壁薄，缺乏緊密的細胞連接，且數(shù)量增多，因此更利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散。本實驗觀察到：子宮頸癌組織中淋巴管分布是不均的，子宮頸癌組織中癌灶中心及邊緣LVD與正常子宮頸組織LVD相比，均明顯增多。宮頸癌組織中淋巴管主要分布在癌周組織，其形態(tài)不規(guī)則，管腔擴大。腫瘤組織內(nèi)部淋巴管呈條狀、孤立或簇狀結(jié)構(gòu)，且管腔小，多呈閉塞狀態(tài)。其原因可能是由于腫瘤組織內(nèi)部癌細胞分裂增生迅速，間質(zhì)靜水壓增高，新生的淋巴管受到擠壓所致。另外，腫瘤細胞侵襲生長也會對新生的淋巴管產(chǎn)生破壞作用[6]。腫瘤組織周圍淋巴管增多、管腔擴大，為腫瘤細胞的擴散提供了更好的轉(zhuǎn)移途徑。本研究結(jié)果顯示，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者其癌灶中心及邊緣LVD均明顯高于盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。說明在宮頸鱗癌中，微淋巴管表達增加與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

本研究結(jié)果還顯示，癌灶邊緣組織LVD與細胞分化程度有一定關(guān)系，與高分化者相比，中分化和低分化者LVD表達明顯增高，其原因可能是中、低分化者與高分化者相比惡性程度高，腫瘤細胞能夠分泌更多的淋巴管生長因子，從而促進腫瘤組織淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，早期子宮頸癌組織中LVD表達增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細胞分化水平等臨床病理因素有關(guān)，淋巴管生成在早期子宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色，Podoplanin標記的微淋巴管密度水平高低可以作為臨床評估預(yù)后的一個指標[7]。

[1] Schacht V, Dadras S S, J ohnson LA, et al. Upregulation of the lymphatic marker podoplanin , a mucin-type transmembrane glycoprotein , in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors [J ] . Am J Pathol , 2005, 166 (3) :913-921.

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[3 ]Schach, T V, Dadras, S.S, Johnson L A, et al. Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors[ J ]. Am J Pathol, 2005, 166 (3): 913- 921.

[4]Wicki, A and G. Christofori The potential role of podoplanin in tumour invasion[ J ]. Br J Cancer, 2007,96(1): 1-5.

[5 ]Schoppmann S F. ,Berghoff A., Dinhof C., et al., Podoplanin-expressing cancer-associated fibroblasts are associated with poor prognosis in invasive breast cancer. [J]Breast Cancer Res Treat, 2012,17.

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Theclinicalsignificanceoflymphaticvesselsdensitystainedbypodoplanininearlystageofcervicalcarcinoma

Wangduping1,Zhangying2,Wangqingyi1

(1. Department of Gynecology, Maternal and Child Health Hospital, Guangdong Zhuhai, 519000; 2. Department of Pathology, Maternal and Child Health Hospital, Guangdong Zhuhai, 519000 )

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of lymphatic vessels density (LVD) stained by podoplanin in early stage of cervical carcinoma.MethodsImmunohistochemical staining by podoplanin was used to detect LVD in 38 cases of early stage of carcinoma of uterine cervix and 12 cases of normal uterine cervix, and the correlation between LVD and tumor clinicopathological features was analyzed.ResultsThe peritumoral LVD(PLVD)and the intratumoral LVD(ILVD)were significantly higher than that of normal uterine cervix (P<0.05). The peritumoral LVD was 12.10 ± 2.83，which was much more than that in the intratumoral carcinoma (7.71 ± 1.12) (P<0.05). The PLVD with lymphatic metastasis was14.67 ±3.72, which was more than that without lymphatic metastasis (10.77±2.65) (P<0.01). The PLVD of histological grade G1, G2 and G3 were 8.29±1.76, 11.31±3.63 and 13.24±0.79, respectively. The PLVD of G2 was more than that of G1 but lower than that of G3 (P<0.05).ConclusionThe increase of LVD in early stage carcinoma of uterine cervix had clinical significance. It was relevant with the clinicopathological factors, such as lymphatic metastasis and cell differentiation. The generation of lymphatic vessels may play an important role in the lymphatic metastasis of cervical carcinoma.

Cervical carcinoma; lymphatic metastasis; podoplanin

R737

A

1000-2715(2012)01-0039-04

珠海市科技局基金資助項目 (NO:珠科2009～42)。

王慶一，男，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤。E-mail:tiger62wang@163.com。

[收稿2011-11-12；修回2011-11-22]

(編輯：譚秀榮)