布 娟 張 瑩 劉 敬 龐紅蕾 林淑芳 王樂今

馬凡綜合征(Marfan syndrome，MFS)是一種常染色體顯性遺傳性結(jié)締組織病，發(fā)病率為1/5000～1/10 000，其中25%～30%的MFS患者為散發(fā)病例。MFS的典型臨床表現(xiàn)主要涉及眼、骨骼和心血管系統(tǒng)。眼部的表現(xiàn)為晶狀體脫位、高度近視伴視網(wǎng)膜脫離;骨骼系統(tǒng)的表現(xiàn)主要包括身材瘦長、脊柱側(cè)凸、細(xì)長指(趾)、胸壁畸形(漏斗胸或雞胸)、蜘蛛腳樣指(趾)、韌帶松弛、異常關(guān)節(jié)運動等;在心血管系統(tǒng)方面，主動脈根部及升主動脈進(jìn)行性擴張所導(dǎo)致的主動脈關(guān)閉不全及夾層主動脈瘤是MFS患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥，二尖瓣脫垂及主動脈瓣返流也是MFS患者常見的心血管系統(tǒng)表現(xiàn)。此外，MFS的損害還可能涉及肺、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[1]。

MFS的發(fā)病原因至今尚不完全清楚，但近年來不斷有研究表明FBN1、TGFBR1、TGFBR2基因的突變可導(dǎo)致MFS的發(fā)生。由于MFS為不完全外顯性遺傳疾病，患者臨床表現(xiàn)多樣化，且在不同家系之間甚至在同一家系的不同患者之間都存在著較大的表型差異。因此，本研究對收集到的一個中國人四代MFS家系進(jìn)行全面的臨床研究，并從已知基因附近選取微衛(wèi)星標(biāo)記物進(jìn)行連鎖分析，以確定致病基因區(qū)域及該家系致病基因是否與已知MFS基因連鎖。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 研究對象取自在北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科就診的一個四代MFS家系，家系41名成員中共有12例患者，男7例，女5例(家系圖見圖1)。本研究遵循赫爾辛基宣言，在家系所有成員均知情同意的情況下，對其進(jìn)行全面的檢查。根據(jù)臨床體征和檢查結(jié)果，確定患者和正常人。根據(jù)Ghent標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行MFS的臨床診斷[2]。該標(biāo)準(zhǔn)如下:MFS特征性的眼部病變、骨骼病變、心血管病變和家族史，凡具備這四項中的任意兩項者，即可確立診斷。

詳細(xì)詢問病史及家族史后檢查視力、屈光度，使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液進(jìn)行散瞳，待瞳孔散大后使用裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡分別檢查眼前節(jié)及眼底。對家系中所有患者均進(jìn)行全面的體檢，包括心臟彩色超聲，脊椎、胸椎正側(cè)位X光片及神經(jīng)系統(tǒng)MRI等檢查。

Figure 1 Family figure of MFS MFS家系圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取外周血8～10 mL，采用美國羅氏公司的DNA分離試劑盒分步提取基因組DNA。紫外分光光度計和6 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA純度和濃度后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星序列的 PCR擴增 在候選基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2相距3 cM范圍內(nèi)，選擇具有高雜合度的微衛(wèi)星標(biāo)記物。引物序列由基因組數(shù)據(jù)庫獲取。PCR擴增體系為5.0 μL(10×GeneAmp PCR 緩沖液0.5 μL、10 mmol·L－1脫氧核糖核苷酸0.1 μL、25 mmol·L－1MgCl20.6 μL、5 ×106U·L－1GoldTMDNA 聚合酶 0.04 μL、10 mmol·L－1引物0.04 μL、30 mg·L－1基因組 DNA 1.0 μL，加水補足至5.0 μL)，PCR 反應(yīng)條件:首先94 ℃ 5 min預(yù)變性，94℃變性30 s，起始退火溫度59℃ 30 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min，共35個循環(huán)。

1.2.3 基因型分析 按照PCR產(chǎn)物的長度，選用適當(dāng)?shù)姆肿觾?nèi)標(biāo)(0.2 μL)并與高純甲酰胺(4.0 μL)、PCR 產(chǎn)物(1.0 μL)混合，95 ℃加熱變性3 min 后，放入冰中驟冷，以保持DNA的單鏈狀態(tài)。毛細(xì)管電泳2.5 h。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Genscan 2.1軟件收集數(shù)據(jù)，泳道線校正，ABI3130型遺傳分析儀自動讀取全部微衛(wèi)星標(biāo)記物的等位基因片段大小。將收集到的凝膠電泳圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號文件，然后進(jìn)行相對分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)校正和擴增片段大小分析。采用Genotyper2.1進(jìn)行基因分型，采用Linkage軟件包(Ver.5.1)的Mlink連鎖分析軟件，在常染色體顯性遺傳兩等位基因系統(tǒng)模式下，設(shè)定雜合子中致病基因的頻率和外顯率分別為0.000 1和0.999 9，設(shè)定各等位片段在群體中具有相同頻率，分別在重組率(θ)為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40 及 0.50 時計算 LOD值。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):LOD值＞1為提示連鎖;LOD值＜－2為否定連鎖。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果 家系中所有患者均具有MFS的眼部表現(xiàn)及骨骼系統(tǒng)表現(xiàn)(見表1)，僅有2例患者具有心血管系統(tǒng)損害。在詢問病史及家族史時，家屬自訴患者Ⅱ∶3、Ⅲ∶11均是由于心臟病(具體診斷不詳)導(dǎo)致死亡。

2.2 遺傳學(xué)連鎖分析結(jié)果 該家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，患病的個體為雜合子。3號染色體微衛(wèi)星標(biāo)記物D3S1609和D3S2432與該家系連鎖，其 LOD值均為正值，D3S2432最大 LOD值為3.22(見表2)，LOD值≥3確定連鎖。

表1 MFS家系患者的臨床檢查結(jié)果Table 1 Clinical examination results of MFS family

表2 微衛(wèi)星位點基因的連鎖分析的LOD值Table 2 Linkage analysis LOD scores of microsatellite markers

3 討論

MFS的診斷主要依據(jù)患者的臨床體征，這些體征主要涉及心血管系統(tǒng)、眼睛系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)?，F(xiàn)在的診斷標(biāo)準(zhǔn)是1996年重新修正后的標(biāo)準(zhǔn):即具有典型的家族史、心血管系統(tǒng)、眼睛系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)的主要診斷體征，以上4項中具備2項就可確診。心血管系統(tǒng)的主要診斷體征為:升主動脈擴張伴或不伴主動脈瓣返流，以及Valsava竇擴張，升主動脈夾層。眼睛系統(tǒng)的主要診斷體征是晶狀體脫位。骨骼系統(tǒng)的主要診斷體征是:雞胸;漏斗胸;上肢伸展長度/身高的比值大于1.05;腕征、指征陽性;脊柱側(cè)彎大于20°，或脊柱前移;肘關(guān)節(jié)外展減小(＜170°);足踝中部關(guān)節(jié)脫位形成平足;任何程度的髖臼前凸(髂關(guān)節(jié)內(nèi)陷)。

本研究收集到的四代家系，經(jīng)詳細(xì)的臨床檢查，確診為MFS。并且其遺傳規(guī)律符合常染色體顯性遺傳。近來越來越多的研究表明FBN1、TGFBR1、TGFBR2基因的突變與MFS的發(fā)生存在著緊密的聯(lián)系[3-7]。對于MFS的遺傳家系來說，約90%MFS家系是由FBN1基因突變引起的。突變后的基因產(chǎn)生異常的FBN-1，通過對正常FBN-1產(chǎn)生顯性負(fù)效應(yīng)，干擾原纖維蛋白的聚合及微纖維的聚集。突變后的FBN1還有可能通過破壞彈性纖維的穩(wěn)定性或本身對蛋白水解酶敏感性的改變等機制導(dǎo)致全身結(jié)締組織的改變[8]。

由于在某些MFS的患者體內(nèi)檢測到了TGFBR1基因和TGFBR2基因的突變，所以提出了MFS的發(fā)生可能與異常的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)信號有關(guān)。TGF-β 是一種分泌多肽，參與細(xì)胞外基質(zhì)形成和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮重要作用。TGF-β與I型和Ⅱ型受體結(jié)合成復(fù)合物，在相應(yīng)配體作用下，通過磷酸化過程，激活跨膜受體，活化的跨膜受體與下游的信號分子相作用從而傳遞活化信號[9]。

當(dāng)TGFBR1和 TGFBR2突變后，影響了 TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體的功能，從而干擾了TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的整個過程。此外，近年來研究顯示:在細(xì)胞外基質(zhì)中，F(xiàn)BN1與TGF-β信號有功能上的相關(guān)性。因此，MFS的病理機制可能與 TGF-β信號異常有關(guān)[10]。

FBN1 基因定位于15q15-q21.1，長230 kb，有65個外顯子，編碼2871個氨基酸的蛋白質(zhì)。TGFBR1基因位于9q22，長49 kb，有9個外顯子，編碼503個氨基酸的蛋白質(zhì)。TGFBR2基因位于3p22，長87kb，有7個外顯子，編碼567個氨基酸的蛋白質(zhì)。其中報道最多的是FBN1基因的突變，該基因最大，外顯子數(shù)目最多，其突變可以發(fā)生在整個基因的任意區(qū)域，沒有集中的突變熱點，這就導(dǎo)致了篩查該基因突變的難度增加。目前國內(nèi)外針對MFS的研究主要是檢測FBN1基因是否存在突變，而基因突變檢出率較低也是目前研究此疾病的最大難題。因此，本研究通過對MFS家系進(jìn)行已知基因的連鎖分析，以期達(dá)到確定該家系致病基因位置的目的，從而不需耗費過多的人力、財力對基因盲目的進(jìn)行直接測序。

連鎖分析是通過尋找與某一遺傳性狀共同傳遞的遺傳性標(biāo)記物來確定某種疾病的致病基因在基因組中的位置。計算最大優(yōu)勢對數(shù)LOD值(即兩個位點確實連鎖的可能性與兩個位點不連鎖的可能性的比值的常用對數(shù)值)，LOD正值代表支持連鎖，≥+3代表確定連鎖，負(fù)值代表不支持連鎖，≤－2代表排除連鎖。本研究中的MFS家系，其致病基因與位于TGFBR2基因附近的微衛(wèi)星連鎖，因此可以推斷MFS的已知致病基因TGFBR2可能是該家系的致病基因。TGFBR2是在2004年新發(fā)現(xiàn)的與MFS的發(fā)病有關(guān)的基因[11]。至今已發(fā)現(xiàn)的TGFBR2基因突變有7個，其突變均發(fā)生在TGFBR2激酶結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸)序列，突變導(dǎo)致TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能失調(diào)。今后的研究工作將對家系患者進(jìn)行TGFBR2基因的直接測序，以期發(fā)現(xiàn)有意義的突變，為進(jìn)一步闡述MFS的分子發(fā)病機制及進(jìn)行家系產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。

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