溫臣婷 唐 微 李國保 張有順

瞼裂狹小綜合征(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES)是一種少見的常染色體顯性遺傳疾病[1]。臨床上以瞼裂狹小、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮及上瞼下垂三聯(lián)征為主要特征。BPES可分為兩種類型:Ⅰ型女性患者不孕，而男性患者可生育，并將這一性狀傳遞給下一代。Ⅱ型患者男女均可生育。研究表明 FOXL2基因定位于3q22.3-3q23區(qū)域[2]，由長2.7 kb的單個外顯子組成。其編碼蛋白質(zhì)屬于forkhead轉(zhuǎn)錄因子大家族，由376個氨基酸組成。目前，雖然國內(nèi)外的學者報道了一些BPES家系或散發(fā)病例，并檢測到病因與其存在的FOXL2基因突變有關(guān)。但是不同的家系其基因突變類型可能并不相同。我們研究的家系中男女患者均可生育，因此確診為Ⅱ型家系病例，其中3名患者以后將存在生育需求。本研究將對一個來自中國連續(xù)傳遞3代BPES家系的FOXL2基因進行突變分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 該BPES家系來自于河南省某縣，共3代5例發(fā)病(其中1例為新生兒未采血)，表現(xiàn)為典型的常染色體顯性遺傳，從第1代發(fā)現(xiàn)第1例患者開始，每一代均有患者，共計男3例，女2例，年齡6個月～60歲。家系圖譜見圖1。該家系所有患者均有典型的瞼裂狹小、上瞼下垂、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮、眥距增寬和弱視(圖2)，其中有3例患者曾在我院接受手術(shù)治療，效果較滿意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA獲取 將家系中4例患者(新生兒血液未采集)及家系中5例正常成員作為研究對象，另外選取30例正常人作為正常對照，均抽取其外周全血約2 mL。利用Omega公司提供的基因組抽提試劑盒，并參照試劑盒使用說明從全血中抽取基因組DNA，置于-20℃保存待用。

Figure 1 Pedigree of BPES patients 患者家系圖

Figure 2 Photographs of patients.A:Photograph of patientⅡ1 after the second phase surgery;B:Photograph of patient ofⅡ2 after the first phase surgery;C，D:Photographs of the patientⅢ1 before surgery(C:Right eye;D:Left eye);E:Photograph of the patientⅢ1 after the first phase surgery 患者照片。A:患者Ⅱ1二期術(shù)后照片;B:患者Ⅱ2一期術(shù)后照片;C、D:患者Ⅲ1手術(shù)前照片(C:右眼，D:左眼);E:患者Ⅲ1一期手術(shù)后照片

1.2.2 PCR 反應 根據(jù) NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫提供的 FOXL2基因序列(Gene ID:668)，設(shè)計合成FOXL2基因的特異引物:從FOXL2基因啟動子區(qū)至整個編碼區(qū)，設(shè)計特異性引物5對(表1)，應用PCR技術(shù)分段擴增FOXL2基因片段。PCR反應體系:總體積為 25 μL，2 × GC buffer Ⅱ12.5 μL，10 mmol·L-1雙向引物各 1 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL，Taq DNA 酶0.25 μL，模板為基因組 DNA 3 μL，余不足用水補齊，反應試劑由大連寶生物公司提供。PCR反應程序:為預變性94℃ 1 min，然后94℃30 s→退火30 s→72℃ 2 min，共35個循環(huán)。擴增后，取PCR產(chǎn)物 25 μL，加 6 × loading buffer 5 μL 上樣，用20 g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR產(chǎn)物大小。切膠回收PCR產(chǎn)物中目的片段，用Promega公司凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，取1 μL目的片段上樣，電泳檢測(瓊脂糖凝膠經(jīng)EB染色)，進一步確認PCR產(chǎn)物為所需片段。用ABI3730DNA測序儀進行測序。

1.2.3 基因分析 對測序獲得的序列與標準序列進行相似序列比對，確定突變位點。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取及其檢測 提取的DNA經(jīng)凝膠電泳檢測，出現(xiàn)一條較整齊、明顯的條帶，條帶＞2 kb，說明提取到的DNA質(zhì)量好，能作為PCR擴增的模板(圖3)。

表1 FOXL2的PCR擴增引物序列、擴增時的退火溫度及擴增片段長度Table 1 Primer sequences，Tm and PCR product length of FOXL2 gene

2.2 PCR產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)，5對引物都擴增到了與預期產(chǎn)物一致的DNA條帶(圖4)，其中AB引物擴增的產(chǎn)物在近500 bp處出現(xiàn)一條帶，與預期的473 bp相一致;CD引物擴增的產(chǎn)物在600～700 bp間出現(xiàn)一條帶，與預期的656 bp相一致;EF引物擴增的產(chǎn)物在近500 bp處出現(xiàn)一條帶，與預期的494 bp相一致;GH引物擴增的產(chǎn)物在近600 bp處出現(xiàn)一條帶，與預期的561 bp相一致;MN引物擴增的產(chǎn)物在近600 bp處出現(xiàn)一條明顯的帶，但位置較GH條帶略高，與預期的579 bp相一致。

2.3 FOXL2基因測序 將上述擴增后的基因片段進行挖膠純化回收后，送到大連寶生物公司進行測序。測序結(jié)果與Genebank中FOXL2序列一致:3代4例患者與家系中的正常成員和30例正常對照中FOXL2基因測序結(jié)果相同，F(xiàn)OXL2基因的編碼區(qū)及啟動子區(qū)測序結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)FOXL2基因的突變(圖5)。說明這些患者的FOXL2基因沒有發(fā)生突變，該家系BPES疾病不是由FOXL2基因突變引起的。

Figure 4 Recycled DNA electrophoresis diagrams of patientⅡ1，Ⅱ2 andⅢ1 患者Ⅱ1、Ⅱ2及Ⅲ1 PCR產(chǎn)物片段電泳圖

Figure 5 Sequence electropherograms of FOXL2.A:AB fragment part sequence electropherograms of FOXL2;B:CD fragment part sequence electropherograms of FOXL2;C:EF fragment part sequence electropherograms of FOXL2;D:GH fragment part sequence electropherograms of FOXL2;E:MN fragment part sequence electropherograms of FOXL2 FOXL2測序圖。A:AB段部分測序圖;B:CD段部分測序圖;C:EF段部分測序圖;D:GH段部分測序圖;E:MN段部分測序圖

3 討論

BPES是一種少見的常染色體顯性遺傳病，在普通人群中的發(fā)病率大約為十萬分之一。本病典型特征為雙眼倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮、上瞼下垂、瞼裂狹小、內(nèi)眥距離增寬等。BPES可分為兩型，I型女性患者因卵巢功能早衰而不育，男性患者生育功能正常。Ⅱ型男女患者因只累及眼瞼故均可生育[3]。I型由父親傳代，女性患者伴有不孕癥，其外顯率100%。Ⅱ型外顯率96%，父母親傳代機會均等[4-5]，在我國所報道的病例中，父親傳代占絕大多數(shù)[6]。本研究家系患者具有典型的臨床特征，女性患者生育能力正常，故屬于BPESⅡ型。家系的患者是通過父親傳代的，父親所生后代均患病，母親所生后代未見異常。

國內(nèi)外大量研究表明，BPES與FOXL2基因突變有高度密切的關(guān)系[7-12]。有散發(fā)突變和遺傳突變。突變形式有:錯義突變、移碼突變(缺失或插入)等。FOXL2基因突變引起聚丙氨酸區(qū)域擴增可導致BPESⅡ型，而突變導致其編碼的蛋白質(zhì)在聚丙氨酸區(qū)域前截斷的則發(fā)生Ⅰ型的風險高[13]。

然而在我們研究的家系中所有患者FOXL2基因的編碼區(qū)及啟動子區(qū)測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)FOXL2基因的突變。其可能原因為:該家系的發(fā)病與FOXL2基因無關(guān)，推測可能有導致該家系患病的其他突變基因存在。此外，也可能與FOXL2基因有關(guān)，因為基因的表達不僅需要正常的編碼序列，同時也需要調(diào)控區(qū)域的作用[14-16]。Crisponi等[15]在距離FOXL2基因5’端轉(zhuǎn)錄起始點171 kb處發(fā)現(xiàn)了平衡易位斷點所致的BPES。Beysen等[14]報道了FOXL2基因外的微小缺失及堿基重排所致的BPES。這些調(diào)控區(qū)域和目標基因相距甚遠，但卻影響FOXL2的表達，從而引起B(yǎng)PES的表型。部分BPES患者的遺傳缺陷可能代表一種基因劑量變化或者FOXL2轉(zhuǎn)錄區(qū)外的基因重排。該實驗只對基因的外顯子區(qū)和少量的內(nèi)含子區(qū)及啟動子區(qū)進行擴增測序，許多內(nèi)含子區(qū)或其他可能的調(diào)節(jié)位點并未檢測，這些可能為該家系的致病原因。除了FOXL2基因異常外，還可能存在其他的遺傳因素和環(huán)境因素的作用?？赡苁荈OXL2基因周圍的位置效應;或是BPES具有遺傳異質(zhì)性。因此對該家系需進一步行傳統(tǒng)的細胞遺傳學調(diào)查，如行微陣列比較基因組雜交技術(shù)等，進一步查找該基因外的調(diào)節(jié)區(qū)域，尋找調(diào)控FOXL2基因表達的遠距離保守非基因序列是否存在異常。

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