茍文軍 劉思源 覃 冬

泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。在真核生物中，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是通過UPP進行降解的[1]。Smad7是 TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路中的重要轉(zhuǎn)導分子，主要受UPP的降解調(diào)節(jié)。因此，本實驗通過觀察泛素-蛋白酶體抑制劑MG132對鏈-脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠模型視網(wǎng)膜上Smad7表達的影響，探討Smad7的表達與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)之間的關(guān)系，從而為DR發(fā)病機制的研究與DR的防治提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 取健康的雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，SPF級，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。將Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，應用隨機數(shù)字表法將動物隨機分為3組:正常對照組、DM+MG132組和DM組，每組大鼠各20只。

1.1.2 主要試劑與儀器 STZ(美國 Sigma公司)、MG132(美國Sigma公司)、兔抗大鼠Smad7單克隆抗體(北京中杉公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)、Accu-CHEK型血糖儀及其配套血糖試紙(瑞士羅氏公司);眼科顯微剪、顯微鑷，前房穿刺刀(美國Alcon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立與標本制作 臨用前將STZ溶解于0.1 mmol·L－1檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中(pH 4.5)，制成10 g·L－1STZ 液。建模前將 60 只Wistar大鼠禁食12 h(禁食不禁飲)，DM組與DM+MG132組一次性腹腔注射50 mg·kg－1STZ液，正常對照組一次性給予等體積的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈測血糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L－1者視為造模成功。自DM模型建立后第3天起，DM+MG132組每天給予MG132 DMSO液(0.1 mg·kg－1)腹腔注射，DM 組和正常對照組每天給予0.1 mg·kg－1DMSO液腹腔注射。每隔兩周測一次血糖及體質(zhì)量，分別于造模后8周和12周時測血糖和體質(zhì)量后并處死各組大鼠。完整取出大鼠的左右眼球，并制成眼杯[2]。再將眼杯置于同一瓶中，取出眼杯后依次梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋供免疫組織化學使用。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.1 mmol·L－1PBS 沖洗 5 min，用 0.1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液(pH=0.6)微波抗原修復(98℃，20 min)，自然冷卻至室溫，0.1 mmol·L－1PBS(pH=7.4)緩沖液沖洗5 min，滴加正常山羊血清(0.1 mmol·L－1PBS緩沖液稀釋)封閉游離的結(jié)合位點，減少非特異性染色，分別滴加1∶20稀釋的Smad7單克隆一抗，正常對照組用PBS代替一抗，4℃過夜。0.1 mmol·L－1PBS 沖洗 5 min，滴加生物素標記的二抗 IgG，37 ℃孵育15 min，0.1 mmol·L－1PBS沖洗5 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，0.1 mmol·L－1PBS 沖洗，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復染后封片。胞核或胞漿被染成棕黃色或棕褐色為陽性細胞，在高倍鏡下(400倍)每張切片隨機拍攝3～5個視野，用Image-Pro Plus 6.0彩色圖像分析系統(tǒng)對圖像中陽性反應部位進行分析。用棕黃色或棕褐色陽性顆粒的平均光密度(optical density，OD)值表示Smad7的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件分析系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各指標采用均數(shù)±標準差(±s)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間的多重比較采用q檢驗(Student-Newman-Keuls)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7高表達(圖1);在造模后8周和12周時，DM組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較正常對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01)(圖2);DM+MG132組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達亦低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01);而DM+MG132組造模后8周和12周時大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較DM組明顯增多(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(均為 P ＜0.01，見表1)。

Figure 1 Smad7 expression in rat retina of normal control group under light microscope(SP staining，×400).There were lots of Smad7 expressions in rat retina 光鏡下觀察正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達(SP染色，×400)。正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上見大量Smad7的表達

3 討論

Figure 2 Smad7 expressions in rat retina of DM group at 8 weeks and 12 weeks under light microscope(SP staining，×400).A:At 8 weeks，Smad7 expression in rat retina in DM group was lower that in normal control group(black arrow);B:At 12 weeks，Smad7 expression was lower significantly in rat retina in DM group(black arrow)光鏡下觀察造模后8周和12周時DM組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達(SP染色，×400)。A:在造模后8周時，大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的陽性表達較正常對照組降低(黑箭頭);B:在造模后12周時，大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達降低更明顯(黑箭頭)

Figure 3 Smad7 expressions in rat retina of DM+MG132 group at 8 weeks and 12 weeks under light microscope(SP staining，×400).A:At 8 weeks，Smad7 expression was increased in rat retina in DM+MG132 group compared with DM group(black arrow);B:At 12 weeks，Smad7 expression was obviously increased in rat retina in DM+MG132 group compared with DM group(black arrow) 光鏡下觀察造模后8周和12周時DM+MG132組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達(SP染色，×400)。A:在造模后8周時，大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較DM組增多(黑箭頭);B:在造模后12周時，大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較DM組明顯增多(黑箭頭)

表1 3組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的OD值比較Table 1 Comparison of OD value of Smad7 in rat retina among three groups(±s)

表1 3組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的OD值比較Table 1 Comparison of OD value of Smad7 in rat retina among three groups(±s)

Note:*P ＜0.01 compared with normal control group;△P ＜0.01 compared with DM group at time point of 8 weeks and 12 weeks

Group n OD value of Smad7 8 weeks 12 weeks Control 20 0.879 3 ±0.001 5 0.960 5 ±0.002 1 DM 20 0.340 8 ±0.000 7* 0.119 3 ±0.002 8*DM+MG132 20 0.486 4 ±0.001 5＊△ 0.590 4 ±0.012 2＊△F 1617 2347 P ＜0.01 ＜0.01

DR是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其主要的特征是視網(wǎng)膜微血管的閉塞和滲出，最終可導致視網(wǎng)膜新生血管的形成和失明。由于DR的發(fā)病機制錯綜復雜，目前關(guān)于DR代謝通路的研究仍不清楚。DR被認為是一個微弱的炎癥反應過程正日益受到重視[3]。近年來，有研究表明，細胞增殖調(diào)控的失常在DR發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用[4]。而細胞因子則貫穿于細胞生長增殖的全過程，介導一系列的炎癥反應和免疫反應，參與DR的發(fā)生發(fā)展。同時UPP能夠高效、高選擇性地對細胞內(nèi)蛋白進行降解，廣泛參與包括細胞生長、分化與凋亡、細胞分泌與吞噬、信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗原遞呈及免疫應答等多種活動過程，也參與了DR的發(fā)生與發(fā)展。Adachi-Uehara等[5]通過觀察發(fā)現(xiàn)，在 DM大鼠和DR患者中氧化磷酸化相關(guān)基因表達增加，同時UPP中泛素表達增加，說明在DR發(fā)生時存在蛋白轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)異常。

TGF-β作為諸多細胞因子中的一種，具有調(diào)控基因表達、細胞增殖與分化、凋亡及使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積的作用[6]，參與 DR的發(fā)生發(fā)展過程。Smad蛋白是TGF-β下游信號的重要轉(zhuǎn)導分子，在TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮著重要作用。TGF-β與其受體結(jié)合后，可激活受體型Smad(R-Smad)即Smad2和Smad3，進而與共同通路型Smad(Co-Smad)形成三聚體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，上調(diào)一些與ECM合成相關(guān)基因的表達，從而引起ECM的沉積。糖尿病時的高血糖、糖基化終末產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ是TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的主要刺激因子[7]。而抑制型Smad(I-Smad)即 Smad7可抑制TGF-β激活的R-Smad磷酸化，從而對TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路起負反饋抑制作用，降低TGF-β信號的強度和持續(xù)時間。因此，Smad7是調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵分子蛋白。Papetti等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Smad2在糖尿病患者視網(wǎng)膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用。Saika等[9]在基因敲除Smad3的小鼠眼中未檢測到纖維連接蛋白和膠原蛋白Ⅵ的表達，說明Smad3可能參與了增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的形成。Saika 等[10]在PVR小鼠模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在Smad7過表達的小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞中，其α-SMA和Ⅰ型膠原均較對照組降低。表明Smad2/3是主要的致纖維化因子，而Smad7是主要的抗纖維化因子，可能在PVR的形成過程中具有保護作用。在本實驗中，我們通過觀察不同時間點各組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常對照組大鼠視網(wǎng)膜上見大量Smad7的表達，而在造模后8周和12周時，DM組與DM+MG132組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較正常對照組明顯減少，且隨著病程的進展，Smad7的減少逐漸增多。說明Smad7對DM大鼠視網(wǎng)膜具有保護作用。

泛素-蛋白酶體抑制劑MG132能夠選擇性地阻斷UPP。Meiners等[11]使用蛋白酶體抑制劑MG132注射治療自發(fā)性高血壓模型大鼠研究發(fā)現(xiàn):MG132可通過抑制NF-κB活化，減少膠原的表達、減輕心肌纖維化。吳燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132可抑制DR大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。為進一步探討泛素-蛋白酶體抑制劑MG132對DR的保護作用，本實驗應用MG132對DM大鼠模型進行干預發(fā)現(xiàn)，在造模后4周和8周時，DM+MG132組大鼠視網(wǎng)膜上Smad7的表達較DM組明顯升高。綜上研究表明，MG132能夠通過抑制Smad7的表達從而對DM大鼠視網(wǎng)膜產(chǎn)生保護作用。

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