司艷芳 王 君 關(guān) 娟 韓泉洪 惠延年

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是視網(wǎng)膜表面和玻璃體后面廣泛纖維增生膜收縮、牽拉而引起的視網(wǎng)膜脫離性疾病，是孔源性視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)失敗的主要原因[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在貓的孔源性視網(wǎng)膜脫離發(fā)生后24 h，脫離視網(wǎng)膜下方的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞核重新開始合成DNA，而在未脫離的區(qū)域未見此現(xiàn)象[3]。RPE細(xì)胞一旦脫離原位，離開自身原有的微環(huán)境開始增殖，便進(jìn)入一種與生長(zhǎng)因子相關(guān)的正反饋?zhàn)苑置谡{(diào)節(jié)狀態(tài)，即細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)因子，而這些生長(zhǎng)因子又刺激細(xì)胞增殖、遷移，合成細(xì)胞外基質(zhì)，發(fā)生形態(tài)學(xué)改變等[4-5]。部分RPE細(xì)胞表現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞樣特征，產(chǎn)生特殊的微絲微管結(jié)構(gòu)，有自身收縮功能，并能介導(dǎo)膠原等細(xì)胞基質(zhì)的收縮[6-7]。這種自分泌調(diào)節(jié)的循環(huán)在血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)的作用下已經(jīng)得到驗(yàn)證[8-9]。

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是在多種類型細(xì)胞胞漿中表達(dá)的、具有收縮功能的細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞移行和收縮功能的基礎(chǔ)。目前對(duì)α-SMA與PVR病變程度的相關(guān)性以及PDGF對(duì)α-SMA在RPE細(xì)胞中表達(dá)的影響研究較少。本研究采用免疫熒光、免疫組織化學(xué)和細(xì)胞爬片等技術(shù)，來研究α-SMA在不同病變程度PVR中的表達(dá)以及PDGF對(duì)人RPE細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與儀器

1.1.1 研究對(duì)象 收集解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院眼科在2005年1月至2006年3月確診為孔源性視網(wǎng)膜脫離伴PVR的患者14例視網(wǎng)膜組織，患者年齡4～63歲，病程2個(gè)月～2 a。PVR病變程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)視網(wǎng)膜學(xué)會(huì)的分級(jí)方法，分為C3～D3。排除外傷性視網(wǎng)膜脫離、PVR、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、Eales病、Coats病等引起的繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離和系統(tǒng)性疾病?；颊逷VR玻璃體均使用Premiere(Storzs公司)玻璃體切割機(jī)進(jìn)行，速度為600～750次·min－1，吸力為40 kPa。用玻璃體鑷取出視網(wǎng)膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院王雨生教授惠贈(zèng)，人RPE細(xì)胞培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑及儀器 BFS(GIBCO)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)，一抗:鼠抗人α-SMA一抗，二抗:羊抗鼠多克隆二抗(武漢博士德公司)，DAB免疫組織化學(xué)試劑盒(丹麥 DAKO公司)，抗 Avidin標(biāo)記的Texas Red(美國(guó)Molecular Probes公司)，抗生物素標(biāo)記的FITC熒光染料(美國(guó)Molecular Probes公司)，PDGF-BB(美國(guó) Sigma公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB公司)，LKB V型超薄切片機(jī)(瑞典)，MR-1024激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)Bio-Red公司)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 14例視網(wǎng)膜表面增生膜(PRM)于4℃用40 g·L－1多聚甲醛固定30 min。經(jīng)脫水、透明和浸蠟后制成5 μm厚的切片并且貼附于用多聚賴氨酸涂片的玻片上。切片用體積分?jǐn)?shù)3%H2O2-甲醇孵育10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，漂洗后于98℃微波爐修復(fù)抗原10 min，冷卻至室溫。滴加正常羊血清(1∶50稀釋)于室溫孵育30 min，后滴加鼠抗人α-SMA一抗(于4℃過夜孵育)。漂洗后滴加抗生物素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆二抗(1∶500稀釋，37℃孵育30 min)。最后滴加ABC復(fù)合物，在顯微鏡下觀察DAB-H2O2顯色反應(yīng)，自來水沖洗終止反應(yīng)。最后經(jīng)蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，封片，于光鏡下觀察、照相。

1.3 免疫熒光染色 石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟，然后進(jìn)行如下操作:滴加正常羊血清(1∶50稀釋)，室溫溫育30 min;漂洗后與鼠抗人α-SMA(1∶50稀釋)一抗混合于4℃孵育過夜;漂洗后與生物素標(biāo)記的二抗(1∶50稀釋)在37℃溫育30 min;最后滴加抗生物素標(biāo)記的Texas Red(1∶1 000稀釋)，于37℃放置30 min。漂洗后用甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相，進(jìn)行定量分析?？瞻讓?duì)照使用PBS代替鼠抗人α-SMA一抗，用體積比1∶50稀釋的正常羊血清作為替代對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照均采用心臟平滑肌組織(該組織中α-SMA有明確的表達(dá))。

1.4 細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn) 生長(zhǎng)良好的人RPE細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶液消化制成單細(xì)胞懸液。將100 μL含有20×106L－1人RPE細(xì)胞的懸液滴于鋪在24孔板底部的無(wú)菌蓋玻片上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成兩組進(jìn)行處理:含有體積分?jǐn)?shù)2%FBS的DMEM處理組(2%DMEM組)和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)組(無(wú)血清DMEM組)。每組培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的 PDGF-BB(0 μg·L－1、1 μg·L－1、50 μg·L－1)混合培養(yǎng)。24 h 后取出細(xì)胞爬片，用0.01 mol·L－1PBS 漂洗 2 次，40 g·L－1多聚甲醛固定好，干燥后于－20℃保存或進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，步驟同1.3。

1.5 結(jié)果判定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)以每個(gè)視野(200×)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本計(jì)算5個(gè)視野，取均值。免疫熒光染色結(jié)果，在595 nm(組織標(biāo)本)或540 nm(細(xì)胞爬片標(biāo)本)激發(fā)光情況下，所有被Texas Red染色的細(xì)胞顯示了強(qiáng)的胞漿內(nèi)紅色熒光。共聚焦顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(200×)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-SMA在不同PVR中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在14例不同級(jí)別的PRM中α-SMA均表達(dá)為陽(yáng)性，但其陽(yáng)性程度存在差異(圖1A)。在6例PVR/C3級(jí)PRM中，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的比率為35/80，呈散在分布，細(xì)胞染色及形狀隨分布區(qū)域的不同有所差異;在8例PVR/D級(jí)的增生膜中，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞約占50/60，多分布于膜表面，染色較深，胞體呈梭形，胞核呈長(zhǎng)圓形(圖1B)，?？梢姶祟惣?xì)胞在膜組織的起伏呈“搭橋樣”，而在組織的中央?yún)^(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少。

免疫熒光與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致(圖1C-圖1D)。熒光定量分析顯示，PVR/C3級(jí)的PRM中α-SMA平均熒光強(qiáng)度為12.31，而 D級(jí) PRM 中 α-SMA平均熒光強(qiáng)度為23.09，是C級(jí)增生膜的1.88倍(P ＜0.01;圖1E-圖1F)。

2.2 PDGF-BB促進(jìn)體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞表達(dá)α-SMA 在無(wú)血清DMEM組的細(xì)胞爬片中，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞占50%～60%，平均熒光強(qiáng)度為10.08;在50 μg·L－1PDGF-BB刺激后，陽(yáng)性細(xì)胞比例增加至80%～90%，平均熒光強(qiáng)度增加至17.23(圖2;P＜0.05)。含有體積分?jǐn)?shù)2%FBS的DMEM處理后，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞比例為80%，添加50 μg·L－1PDGFBB后，幾乎全部的細(xì)胞均表達(dá)α-SMA，且熒光強(qiáng)度明顯增加，分別為無(wú)血清DMEM、無(wú)PDGF-BB作用組和2%DMEM、無(wú)PDGF-BB作用組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的2.0 倍和1.5 倍，達(dá)到21.36(表1)。

Figure 1 Expression of α-SMA in PRM of PVR with different grades.A，B:Distribution of α-SMA in PRM with grade C and D detected by Immunohistochemistry;C，D:Expression of α-SMA in PRM with grade C and D detected by immunofluorescence;E，F(xiàn):Fluorescence intensity of α-SMA in PRM of PVR with different grades α-SMA在不同病變程度PVR的PRM中表達(dá)不同。A、B:免疫組織化學(xué)檢測(cè)α-SMA在PVR C級(jí)增生膜和D級(jí)增生膜中的分布;C、D:免疫熒光檢測(cè)α-SMA在PVR C級(jí)增生膜和D級(jí)增生膜中的表達(dá);E、F:α-SMA在不同級(jí)別PVR增生膜中表達(dá)的熒光定量分析結(jié)果

表1 不同濃度PDGF對(duì)人RPE細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響Table 1 Effects of PDGF with different concentrations on expression of α-SMA in human RPE cells(fluorescence intensity)

無(wú)血清DMEM組和2%DMEM組間熒光強(qiáng)度(P=0.026 7＜0.05)和不同PDGF濃度組間(P=0.010 6＜0.05)均存在顯著性差異，這一結(jié)果顯示不同濃度的PDGF均能顯著促進(jìn)α-SMA在人RPE細(xì)胞中的表達(dá)。進(jìn)行線性相關(guān)分析顯示，PDGF濃度與人RPE細(xì)胞α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)，即PDGF-BB促進(jìn)α-SMA在人RPE中的表達(dá)呈劑量依賴性，而且培養(yǎng)基中的血清能明顯增強(qiáng)這一作用(圖2)。

3 討論

Figure 2 PDGF-BB promoted the expression of α-SMA in human RPE cell cultured in vitro in a dose-dependent manner.A:The effect of different concentration of PDGF in DMEM group with no serum and 2%DMEM group on the expression of α-SMA;Expression of α-SMA after PDGF-BB treatment with concentration of 0 μg·L－1(B)and 50 μg·L－1(C)for 24 hours in 2%DMEM group PDGF-BB 以劑量依賴性促進(jìn)體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞表達(dá)α-SMA。A:無(wú)血清DMEM組和2%DMEM組中不同濃度PDGF-BB對(duì)α-SMA表達(dá)的影響;2%DMEM組0 μg·L－1(B)和50 μg·L－1(C)PDGF-BB處理人RPE細(xì)胞24 h后α-SMA的表達(dá)情況

α-SMA是表達(dá)在多種類型細(xì)胞漿中的一組具有收縮功能的骨架微絲結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞移行和收縮的基礎(chǔ)[10]。α-SMA可作為一種特異性的免疫組化染色標(biāo)志分子識(shí)別肌纖維母細(xì)胞。Lewis等[4]報(bào)道，PRM中存在一種有足突的人RPE細(xì)胞，在電鏡下觀察時(shí)這些細(xì)胞內(nèi)有大量的微絲，同時(shí)細(xì)胞有收縮的現(xiàn)象。在這些細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間存在多種形式的細(xì)胞連接，這些細(xì)胞連接對(duì)組織的收縮功能有重要的作用。細(xì)胞的這些特點(diǎn)與肌成纖維細(xì)胞非常相似[11]。人RPE細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)型可能對(duì)PVR的發(fā)生有重要的作用。脫離原位的RPE上皮表型以及胞漿內(nèi)的色素顆粒逐漸消失，合成多種細(xì)胞外基質(zhì)，并表達(dá) α-SMA。α-SMA 的表達(dá)導(dǎo)致眼內(nèi)過度的損傷愈合，收縮能力持續(xù)增加。α-SMA的持續(xù)表達(dá)對(duì)PVR的發(fā)生有重要的意義。我們的研究結(jié)果顯示，在 PVR/C級(jí)增生膜中，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞較多，但細(xì)胞著色淺，說明α-SMA在這些細(xì)胞中的表達(dá)較弱。而在PVR/D級(jí)增生膜中，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，但細(xì)胞染色明顯加深，熒光定量分析結(jié)果顯示α-SMA在D級(jí)增生膜中的表達(dá)量為C級(jí)增生膜的1.88倍。從α-SMA的分布來看，其附著點(diǎn)位于增生膜收縮的“受力點(diǎn)”位置。從人RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)型特點(diǎn)來看，C級(jí)增生膜RPE細(xì)胞輕度表達(dá)α-SMA可能與細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)、移行以及具有一定的收縮能力有關(guān)。而在D級(jí)增生膜中，RPE細(xì)胞α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng)可能與其收縮能力增強(qiáng)有關(guān)，這種α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞在數(shù)量和空間分布上的差異可能是RPE細(xì)胞在增生膜中位置不同受到的應(yīng)力不同的結(jié)果。

在PVR的發(fā)病過程中，多種細(xì)胞和細(xì)胞因子都參與其中。PDGF是一種普遍存在的有絲分裂劑，其與PDGF受體結(jié)合后，激活具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受體，直接促進(jìn)有絲分裂，誘導(dǎo)有絲分裂反應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的增生反應(yīng)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞表達(dá)α-SMA，而且當(dāng)血清存在時(shí)這種促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)。血清中存在的多種因子可能對(duì)α-SMA的表達(dá)也有促進(jìn)作用，PRM中多種細(xì)胞因子對(duì)α-SMA的協(xié)同作用導(dǎo)致 α-SMA表達(dá)量升高，從而影響PVR。

綜上所述，PVR增生膜中α-SMA的表達(dá)量與PVR的病變程度呈正相關(guān);PDGF-BB能促進(jìn)人RPE細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，而且血清的存在能明顯促進(jìn)這一作用。α-SMA和PDGF在PVR的發(fā)病中都有重要的作用。對(duì)PDGF信號(hào)通路的研究將更加有助于揭示其確切的作用機(jī)制，為PVR的預(yù)防及治療提供新的思路。

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