王 珺，劉曉亮，劉彩霞，趙彥艷

(中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院1.婦產(chǎn)科，2.臨床遺傳科，遼寧沈陽 110004)

2，3，7，8-四氯二苯-對-二噁英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是二噁英類環(huán)境污染物中毒性最強的一種，主要來源于垃圾焚燒、農(nóng)藥生產(chǎn)和汽車尾氣等。TCDD在自然界廣泛存在，具有致畸、致癌、致突變作用［1］。此外，TCDD還損害免疫、皮膚等多個系統(tǒng)功能［2－3］。TCDD 對不同組織細胞呈現(xiàn)不同作用，它可誘導免疫細胞凋亡，使胸腺萎縮、免疫功能下降［2］;而在其他組織，TCDD 則會抑制細胞凋亡以及促進癌變［4］。

胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor 2，IGF2)是一個主要在胚胎期表達的重要生長因子，出生后其在各器官表達水平迅速下降［5］。IGF2過度表達可導致組織細胞異常增生，與Beckwith-Wiedemann綜合征等先天畸形性疾病發(fā)生有關(guān)［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，TCDD致畸胎鼠的肝組織中Igf2基因表達增高［7］。

為探索肝細胞增殖及凋亡在TCDD致機體損害中的作用，以及Igf2基因表達與二者間的關(guān)系，本研究以大鼠肝BRL-3A細胞為研究對象，觀察TCDD對該細胞增殖和凋亡的影響，檢測 Igf2基因在BRL-3A細胞中的表達，探討TCDD致畸、致癌和致突變作用可能的新機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑及主要儀器

Trizol試劑購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購自Promega公司;噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma公司;蛋白質(zhì)測定試劑購自南京建成生物工程研究所;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640購自Gibco公司。TCDD購自Cambridge Isotope Laboratories公司，用 DMSO配成溶液備用。堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IGF2IgG抗體和β肌動蛋白抗體購自Santa Cruz公司。PCR探針及引物由TaKaRa公司合成。

1.2 主要儀器

Olympus TH4-200倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;Bio-RAD550酶標儀和Gel Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;CL-1000紫外交聯(lián)儀為美國UVP公司產(chǎn)品;FASCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。Rotorgene 2000實時定量PCR儀為加拿大MBI公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)

大鼠肝BRL-3A細胞購自中國科學院上海細胞研究所。在含15%FCS、青霉素 100 kU·L－1、鏈霉素100 mg·L－1的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)體系中，置37℃，體積分數(shù)為5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁生長。2～3 d傳代1次，實驗均選用對數(shù)生長期細胞。接種后，常規(guī)培養(yǎng)24 h，實驗組分別加入不同濃度的TCDD，溶劑對照組加入等體積100%DMSO(DMSO終濃度不超過0.1%)。

1.4 MTT法檢測細胞存活

密度為1×108L－1BRL-3A細胞接種96孔板，分別加入 TCDD 0，5，10，15 和 20 nmol·L－1(每個濃度3 個孔，TCDD 0 nmol·L－1為溶劑對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入20 μl MTT(5 g·L－1)作用 4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100μl DMSO。同時設(shè)僅加等體積培養(yǎng)基、MTT和 DMSO的孔為本底對照孔。15 min后，酶標儀測定490 nm波長處吸光度(A)值，細胞存活 率 (%)=(A實驗組－ A本底對照)/(A溶劑對照組－A本底對照)×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

1.5.1 紫外線誘導BRL-3A細胞

取BRL-3A細胞棄培養(yǎng)基保持濕潤置于紫外交聯(lián)儀內(nèi)，以 254 nm 波長，120 J·cm－2能量垂直照射0 min或2 min，再加入培養(yǎng)基孵育2 h。然后實驗組加入 TCDD 10 nmol·L－1，溶劑對照組加入等體積100%DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，70%無水乙醇固定。復以RNA酶37℃孵育30 min，消除RNA對DNA量的干擾。調(diào)整細胞密度至 5×109L－1，加入等體積 PI 50 mg·L－1染液。用流式細胞儀進行單色熒光細胞流式計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比，每組實驗重復3次。

1.5.2 血清饑餓誘導BRL-3A細胞

取 BRL-3A 細胞，實驗組加入 TCDD 10 nmol·L－1、溶劑對照組加入等體積100%DMSO的有血清和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72和120 h，然后收集細胞，PI染色行流式細胞計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比，每組實驗重復3次。

1.6 熒光定量PCR方法檢測Igf2基因表達

取BRL-3A細胞，實驗組給予TCDD 10 nmol·L－1作用2，4，6，16及24 h，溶劑對照組給予等體積的100%DMSO，然后收集細胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為模板，進行擴增。Igf2基因特異性引物和熒光探針序列為:上游:5'-GCCCTCCTGGAGACATACTG-3'， 下 游:5'-CCAGGTGTCGAATTTGAAGAA-3'，探針:5'-(FAM)-TCCGAGAGGGACGTGTCTAC-(TAMRA)-3'。反應(yīng)體系包括:cDNA 1.0 μl，10 × PCR 緩沖液 2.0 μl，dNTPs 0.5 μl，引物各1μl，探針1μl，Taq酶5 U，加去離子水至總體積20μl，在實時定量PCR儀上進行擴增，反應(yīng)條件為50℃ 120 s，94℃ 120 s預變性，然后 94℃ 15 s，53℃30 s，65℃ 30 s循環(huán)40次。內(nèi)對照β肌動蛋白的反應(yīng)條件相同，其特異性引物和熒光探針序列為:上游:5'-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3， 下 游:5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'，探 針:5'-(FAM)-CCTCCATCGTGCACCGCAA-(TAMRA)-3'。每個樣品擴增3次，計算平均Ct值，以Igf2和β肌動蛋白表達量之比代表每個樣品Igf2的相對含量。

1.7 Western印跡法檢測IGF2蛋白表達

取BRL-3A細胞，實驗組加入TCDD 10 nmol·L－1作用6和24 h，溶劑對照組加入等體積的100%DMSO，然后收集細胞，用單去污裂解液方法提取總蛋白，用Bradford法進行蛋白定量。取50μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳(成層膠濃度5%，分離膠濃度10%)分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上(40℃，200 mA，1.5 h)。轉(zhuǎn)印膜用 5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，再與一抗和二抗孵育，充分洗膜后加入顯色劑反應(yīng)至特異性條帶出現(xiàn)，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶積分光密度值(integrated absorbance，IA)，以目的條帶與β肌動蛋白的IA比值代表IGF2蛋白的表達量。每個樣品重復3次取平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TCDD對BRL-3A細胞增殖的影響

表1結(jié)果顯示，與溶劑對照組比較，經(jīng)過TCDD 5～20 nmol·L－1處理后，細胞存活率明顯增加(P ＜0.05)，TCDD 10 nmol·L－1處理組 BRL-3A 細胞存活率為(122.6±1.2)%，明顯高于其他濃度TCDD作用細胞的存活率(P＜0.01)。所以在以后的研究中，采用 TCDD 10 nmol·L－1作為刺激濃度。

Tab.1 Effect of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)on BRL-3A cell survival

2.2 TCDD對BRL-3A細胞凋亡的影響

2.2.1 TCDD對紫外線誘導的BRL-3A細胞凋亡的抑制作用

圖1結(jié)果顯示，無照射的溶劑對照組細胞凋亡率為(7.3 ±2.6)%(圖 1A)，TCDD 10 nmol·L－1組細胞凋亡率為(6.7±3.2)%(圖1B)，二者間無顯著性差異。經(jīng)紫外線照射2 min后，溶劑對照組細胞凋亡率為(26.4±5.0)%(圖1C)，與無照射的溶劑對照組相比顯著增加(P＜0.05);加入 TCDD 10 nmol·L－1共培養(yǎng)24h細胞的凋亡率為(12.2 ±3.2)%(圖1D)，顯著低于照射的溶劑對照組(P＜0.05)，說明TCDD能夠明顯降低紫外線誘導的BRL-3A細胞凋亡。

Fig.1 Effect of TCDD on BRL-3A apopotosis induced by UV radiation detected by flow cytometry.A:BRL-3A cells cultured with DMSO for 24 h;B:BRL-3A cells cultured with TCDD 10 nmol·L － 1 for 24 h;C:BRL-3A cells treated with UV for 2 min and then cultured with DMSO for 24 h;D:BRL-3A cells treated with UV for 2 min and then cultured with TCDD 10 nmol·L －1 for 24 h.

2.2.2 TCDD對血清饑餓誘導的BRL-3A細胞凋亡的抑制作用

表2和圖2結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間的溶劑對照組和TCDD 10 nmol·L－1組細胞的凋亡率無顯著性差異。血清饑餓72和120 h后，溶劑對照組與TCDD 10 nmol·L－1組凋亡率均顯著增加(P＜0.01);TCDD 10 nmol·L－1+ 血清饑餓組細胞的凋亡率明顯低于血清饑餓+溶劑對照組(P＜0.05)，表明TCDD對血清饑餓誘導的凋亡具有抑制作用。

Tab.2 Effect of TCDD on BRL-3A apoptosis induced by serum free culturing

Fig.2 Effect of TCDD on BRL-3A apopotosis induced by serum free culturing detected by flow cytometry.A:normal medium+DMSO for 72 h;B:normal medium+TCDD 10 nmol·L －1 for 72 h;C:serum free medium+DMSO for 72 h;D:serum free medium+TCDD 10 nmol·L － 1 for 72 h;E:normal medium+DMSO for 120 h;F:normal medium+TCDD 10 nmol·L － 1 for 120 h;G:serum free medium+DMSO for 120 h;H:serum free medium+TCDD 10 nmol·L －1 for 120 h.

2.3 TCDD對BRL-3A細胞Igf2 mRNA表達的影響

圖3結(jié)果顯示，溶劑對照組BRL-3A細胞的Igf2 mRNA表達相對量為 0.037 ±0.003，TCDD 10 nmol·L－1作用后，Igf2 基因的表達量顯著增高(P＜0.05)，TCDD作用6和24 h時 Igf2基因的表達量分別比對照組增高1.12倍和1.67倍。且TCDD調(diào)節(jié)表達的程度與作用時間有關(guān)，TCDD作用6 h前Igf2 mRNA的表達量與TCDD作用時間呈正相關(guān)(r=0.982，P=0.018)，TCDD 作用 6 h 之后Igf2 mRNA的表達增加趨勢趨于平緩。

Fig.3 Effect of TCDD 10 nmol·L －1 on insulin-like growth factor 2(Igf2)mRNA expression in BRL-3A cells.±s，n=3.*P ＜0.05，compared with the 0 h group.

2.4 TCDD對BRL-3A細胞 IGF2蛋白表達的影響

圖4 結(jié)果顯示，溶劑對照組IGF2蛋白表達相對量為0.17 ±0.05，TCDD 10 nmol·L－1作用 6 和 24 h后，IGF2蛋白表達相對量分別為0.51 ±0.06，0.61 ±0.05，分別為溶劑對照組的3倍和3.6倍，有顯著升高(P ＜0.05)。

Fig.4 Effects of TCDD on the expression of IGF2 protein in BRL-3A cells by Western blotting.Lane 1:solvent control group，lane 2:TCDD 10 nmol·L －1 for 6 h;lane 3:TCDD 10 nmol·L －1 for 24 h.

3 討論

本研究結(jié)果顯示TCDD能促進BRL-3A細胞增殖，并以 TCDD 10 nmol·L－1作用最強。TCDD 10 nmol·L－1對紫外照射和血清饑餓誘導的BRL-3A細胞凋亡均有明顯抑制作用。

組織細胞的異常增殖和凋亡被認為與癌變和畸形發(fā)生相關(guān)［8］。本結(jié)果顯示TCDD能刺激大鼠肝細胞增殖、抑制其凋亡，這可能是TCDD致畸和致癌作用的途徑之一。

IGF2是一個重要的促細胞增殖的生長因子，其過度表達與腫瘤和先天畸形的發(fā)生相關(guān)［6，9］。TCDD作用24 h可引起B(yǎng)RL-3A細胞Igf2基因的表達顯著增高——mRNA表達增高1.67倍，蛋白表達增高2.6倍。TCDD調(diào)節(jié)靶基因表達的主要作用途徑是與芳香化烴受體結(jié)合，再與細胞核內(nèi)的芳香化烴受體核轉(zhuǎn)運體蛋白(Ah receptor nuclear translocator protein，ARNT)形成復合物，作用于靶基因上的二噁英反應(yīng)元件(dioxin response element，DRE)，實現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)基因表達，而產(chǎn)生毒性作用［10－11］。TRANSFAC-TESS和MATCHTM是常用的在線轉(zhuǎn)錄因子預測軟件［12］，通過軟件對Igf2基因進行分析并未發(fā)現(xiàn)該基因啟動子上存在DRE。此外，TCDD作用于BRL-3A細胞所引起的Igf2基因mRNA增高的程度與IGF2蛋白上升的程度并不完全一致，這可能與蛋白翻譯過程的各個環(huán)節(jié)還受到不同的調(diào)節(jié)有關(guān)。TCDD上調(diào)Igf2基因表達方式尚待進一步研究。

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