楊一萍，駱 媛，王永安，范禮斌

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，安徽合肥 230032;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理學(xué)研究室，北京 100850)

近幾年缺血性腦血管病發(fā)病率、病死率及致殘率仍呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康，而腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，IRI)危害更大。腦IRI，是指各種原因造成腦部組織血液灌流量減少或停止，重新恢復(fù)血液灌流后，其損傷反而加重的現(xiàn)象。關(guān)于腦IRI發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全闡明，但既往研究已證實(shí)，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體與腦缺血再灌注所致的腦損傷存在密切關(guān)系［1］。NMDA受體是興奮性谷氨酸離子型受體的一種，主要存在于大腦皮質(zhì)和海馬，有NR1，NR2，NR3和NR4四種離子類型。其中，NR2是重要的調(diào)節(jié)亞單位，有NR2A，NR2B，NR2C和NR2D 4個(gè)剪接體。研究發(fā)現(xiàn)，NR2A和NR2B均參與了IRI過程，但其在IRI發(fā)生中的表達(dá)變化和作用尚存爭議［2］，并且目前的研究多集中在RNA水平，缺乏蛋白質(zhì)水平的研究。而在生物體內(nèi)發(fā)揮功能效應(yīng)的是蛋白質(zhì)，故本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，Western印跡法和組織病理學(xué)等方法，從mRNA和蛋白水平觀察腦IRI后大鼠大腦皮質(zhì)NR2A和NR2B表達(dá)的變化，探討NR2A/2B的表達(dá)與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷的關(guān)系，以期進(jìn)一步明確NMDA受體亞單位在IRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年 Sprague-Dawley大鼠，♂，體質(zhì)量240～270 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-2009。

1.2 試劑及器材

水合氯醛、肝素鈉、甲醛、二甲苯和乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂糖和丙烯酰胺購自Merck公司;十二烷基硫酸鈉、雙-丙烯酰胺、AP、Tris堿、TEMED和甘氨酸購自 Amresco公司;Prime ScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品;Trizol購自Invitrogen公司;抗NR2A單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品;抗NR2B單克隆抗體為Millipore公司產(chǎn)品;抗β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體，HE染色試劑盒均購自中杉金橋公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、RIPA裂解液均為凱基生物公司產(chǎn)品;其他化學(xué)試劑均為分析純。MCAO栓線(2636-4A)購自北京沙東生物技術(shù)有限公司;RM2135石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司，生物顯微鏡(BA400T)購自麥克迪奧實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;紫外分光光度計(jì)(UV-4802)購自尤尼柯儀器有限公司;熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀、電泳儀、半干電轉(zhuǎn)膜儀和凝膠呈像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 MCAO大鼠模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

參考Zea Longa法，分別于麻醉清醒后對(duì)MCAO大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分:0分為無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，即左側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲;2分為自主運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分為身體向左側(cè)傾倒;4分為不能自主行走并伴有意識(shí)障礙。

模型納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果神經(jīng)功能評(píng)分為2～3分的大鼠梗死體積為(28±4)%;Bederson等［3］的研究發(fā)現(xiàn)線栓法制備的MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為2～3分對(duì)應(yīng)的梗死體積在(27±6)% ～(28±5)%，說明建立的MCAO大鼠具有穩(wěn)定性和可復(fù)制性，故將復(fù)制成功的神經(jīng)功能評(píng)分為2～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)組。

模型剔除標(biāo)準(zhǔn):無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕及有嚴(yán)重意識(shí)障礙的大鼠;術(shù)中出血過多或蛛網(wǎng)膜下腔出血、MCA起始部或Willis環(huán)有凝血塊的大鼠。

1.4 MCAO大鼠模型的建立及分組

54只SD大鼠隨機(jī)分為6組:①假手術(shù)組;②再灌注后6，12，24，48及96 h組，每組各9只動(dòng)物。大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛3 ml·kg-1腹腔麻醉后仰臥位固定，取頸部偏右側(cè)切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈 (common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)。結(jié)扎ECA，將栓線尾部與CCA成30°角從CCA緩慢插入 ICA，插入長度為18～20 mm(從CCA分叉處計(jì)算)，固定栓線，縫合消毒，缺血2h后將栓線緩慢抽出實(shí)施再灌注，待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)評(píng)分。于各時(shí)間點(diǎn)再次麻醉，以肝素20 kU·L-1化生理鹽水灌流心臟，迅速取腦。由于半暗帶和梗死區(qū)的界限不易確定，為滿足無RNA酶的實(shí)驗(yàn)要求，以肉眼觀察大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷區(qū)與正常皮質(zhì)之間的水腫線為界，實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡實(shí)驗(yàn)的取材部位和HE染色觀察的部位均為水腫線以內(nèi)包括半暗帶和梗死區(qū)的皮質(zhì)組織。

1.5 HE染色觀察病理改變

每組各取3只完整大腦行4%甲醛固定，視交叉處冠狀面切片，二甲苯洗2次，每次5～10 min，95%乙醇洗2次，每次3 min，2 min，80%乙醇1 min，蒸餾水1 mim，蘇木精液染色12 min，流水稍洗去蘇木精液1 ～3 s，1%鹽酸乙醇1 ～3 s，稍水洗 20 s，促藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗15 min，蒸餾水過洗2 s，0.5%蘇紅液染色2 min，蒸餾水稍洗2 s 80%乙醇稍洗1～2 s，95%乙醇洗2次，每次3 min，無水乙醇10 min，二甲苯洗3次，每次3 min，用滴加中性樹脂的蓋玻片封片，通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，光學(xué)顯微鏡下觀察并照相，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.6 RT-PCR檢測NR2A，NR2B mRNA的表達(dá)

1.6.1 RNA 抽提和逆轉(zhuǎn)錄 cDNA

取各時(shí)間點(diǎn)MCAO大鼠梗死區(qū)及半暗帶大腦皮質(zhì)約100 mg，Trizol法抽提大腦皮質(zhì)總RNA，加適量RNase-free水溶解。紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280吸光度，計(jì)算RNA的濃度和純度。取5μl RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，15 min，凝膠成像儀顯示，可見28 S，18 S和5 S三條帶，其中前兩條帶的相對(duì)亮度為2∶1說明RNA完整性好，無明顯降解。A260/A280均在1.8～2.0，說明純度較好，沒有蛋白和苯酚的污染。

在1μg總 RNA樣本中加入 gDNA Eraser 0.5 μl，5×緩沖液2 μl無 RNase水至10 μl。反應(yīng)條件:42℃變性2 min，以消除可能存在的gDNA污染。0.5 μl PrimeSeript RT Enzyme，0.5 μl Oligo dT 引物50 μmol·L-1，0.5 μl隨即引物(100 μmol·L-1)，5 ×緩沖液 2μl，已去除 gDNA 的 RNA 10μl，加無RNase水至 20 μl。反應(yīng)條件:37℃ 15 min，85℃5 s。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃冰箱長期保存。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

根據(jù) NR2A，NR2B和 β肌動(dòng)蛋白基因在GenBank的序列，經(jīng)Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并由Invitrogen公司合成。應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，以10倍稀釋、5個(gè)濃度梯度的cDNA樣本，分別建立NR2A，NR2B和β肌動(dòng)蛋白基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定它們的擴(kuò)增效率并采用最佳擴(kuò)增效率(E=90% ～110%)的反應(yīng)體系條件進(jìn)行檢測。25μl反應(yīng)體系包括:SYBR Ex Taq 12.5 μl，0.5 μl上游引物 10 μmol·L-1，0.5 μl下游引物 10 μmol·L-1，0.5 μl cDNA 10 μmol·L-1，11μl ddH2O。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束后采集熒光。為確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，條件如下:65～95℃，每5 s上升0.5℃。每組樣本設(shè)定無cDNA模板反應(yīng)孔為陰性對(duì)照;每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，重復(fù)間允許的差異小于0.5 ct。用BioRad ManagerTM軟件分別測定每個(gè)樣本NR2A/2B的相對(duì)拷貝數(shù)。

Tab.1 Primer sequences of genes sequences in real time-PCR

1.7 Western印跡法檢測NR2A和NR2B蛋白表達(dá)

取各時(shí)間點(diǎn)MCAO大鼠梗死區(qū)及半暗帶大腦皮質(zhì)約100 mg，加入蛋白裂解液1 ml，冰上超聲破碎，4℃，9168×g，離心15 min制備組織蛋白勻漿液，BCA法測定蛋白濃度。分別灌制8%和5%SDS-聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。半干轉(zhuǎn)印法60 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗，分別為抗NR2A單克隆抗體(1∶5000)、抗NR2B單克隆抗體(1∶1000)，內(nèi)參抗 β肌動(dòng)蛋白抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日 TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗(1∶7000)，室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光檢測雜交信號(hào)，X線片壓片曝光，凝膠圖像分析其積分光密度值，NR2A，NR2B蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量來校正，即目的蛋白相對(duì)表達(dá)量 =IANR2A蛋白/IAβ肌動(dòng)蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)改變

與假手術(shù)組相比，再灌后6 h，腦梗死區(qū)顏色變淺，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少、排列紊亂，組織結(jié)構(gòu)疏松、血管擴(kuò)張(圖1B箭頭所示)，錐體細(xì)胞核固縮成圓形或橢圓形;隨著再灌注時(shí)間的延長，腦損傷程度逐步加重，12 h時(shí)可見血管內(nèi)淤血(如圖1C箭頭所示);再灌后24 h損傷最嚴(yán)重，梗死區(qū)出現(xiàn)大量的核固縮核溶解等典型的細(xì)胞凋亡特征性表現(xiàn)，幾乎看不到正常神經(jīng)元細(xì)胞(如圖1D箭頭所示);48 h出現(xiàn)大面積角質(zhì)化(如圖1E箭頭所示)，96 h可見炎癥細(xì)胞浸潤(如圖1F箭頭所示)。

Fig.1 Pathological changes of rat cerebral cortex at different time points after ischemia(2 h)reperfusion injury(I/R)(HE ×400).A:sham;B-F:6，12，24，48 and 96 h after I/R.

2.2 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)NR2A/2B mRNA表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測了MCAO大鼠皮質(zhì)NMDA受體亞單位NR2A/2B mRNA在再灌注后不同時(shí)間表達(dá)變化(表2)。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，再灌注后6 h皮質(zhì)NR2A mRNA水平表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，再灌注24 h，NR2A/2B均降至最低，NR2A∶NR2B 的比值由1∶1變?yōu)?1∶2;而后NR2A及NR2B表達(dá)又逐漸升高，至再灌注后96 h，NR2A∶NR2B 恢復(fù)至1∶1。

Tab.2 mRNA Expression of NR2A/2B in the cerebral cortex of rat at different time points after I/R

2.3 局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質(zhì)NR2A/2B蛋白表達(dá)水平

圖2結(jié)果顯示，再灌注后6 h，大鼠大腦皮質(zhì)NR2A/2B蛋白表達(dá)開始下調(diào)，NR2B與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);此后，兩者進(jìn)一步下調(diào)，并于再灌后24 h降至最低(P＜0.01)(圖2);再灌后48 h出現(xiàn)上調(diào)，96 h兩者蛋白的表達(dá)也為1∶1且已接近正常水平。與NR2B蛋白表達(dá)不同，盡管NR2A蛋白表達(dá)總體呈先降低后升高趨勢;但在觀察的整個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，NR2A蛋白有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下調(diào)僅出現(xiàn)在再灌后24 h(P＜0.05)，在其他各時(shí)間點(diǎn)，NR2A蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比未見顯著改變。

Fig.2 Expression of NR2A/2B protein in the cerebral cortex of rat at different time points after I/R.C was the semiquantitative result of A and B.1.sham，2.6 h after I/R;C:12 h after I/R;D:24 h after I/R;E:48 h after I/R;F:96 h after I/R.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，compared with sham group.

3 討論

關(guān)于NR2主要受體亞單位NR2A/2B在IRI后不同時(shí)間表達(dá)變化，目前仍存在明顯爭議。Liu等［4］發(fā)現(xiàn)IRI后，海馬神經(jīng)元 CA1區(qū)NR2A/2B的mRNA水平呈先降低后增高趨勢，NR2B的變化尤為顯著;而 Cascón等［5］則認(rèn)為 NR2B 表達(dá)下調(diào)與NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性有關(guān)，NR2A表達(dá)上調(diào)可能與促進(jìn)IRI中的細(xì)胞存活有關(guān);Dos-Anjos等［6］研究證實(shí)，在 IRI早期，NR2A mRNA 與 2B mRNA表達(dá)比例失衡，引發(fā)NMDA受體結(jié)構(gòu)和功能改變，可能是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的重要原因。需要說明的是，這些研究，多單純局限于mRNA或蛋白水平;但 mRNA水平并非絕對(duì)預(yù)示其相應(yīng)蛋白水平［7］，因此，本研究在同一個(gè)動(dòng)物模型上，同時(shí)開展mRNA及其相應(yīng)蛋白表達(dá)，以及腦皮質(zhì)病理學(xué)改變相關(guān)性的研究。

本實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)結(jié)果表明，腦缺血再灌后6 h，大腦皮質(zhì)即出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，再灌后24 h，損傷最為嚴(yán)重;RT-PCR及Western印跡法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在再灌后6 h，最為明顯的改變是NR2B蛋白水平的顯著下調(diào);之后至96 h，NR2A/2B mRNA及蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，24 h至最低;除此之外，在再灌后12 h及24 h，存在NR2A及NR2B mRNA比例失衡，其mRNA比值由1∶1升至1∶2，至96 h兩者的比值達(dá)到1∶1，蛋白表達(dá)也已接近假手術(shù)組水平。這表明再灌24 h后NR2A/2B的基因和蛋白表達(dá)均處于最低水平且兩者的mRNA比值發(fā)生改變與24 h病理損傷嚴(yán)重之間存在時(shí)間一致性，因此推測在IRI中神經(jīng)元的損傷可能與NR2A/2B的表達(dá)變化有關(guān)。

NR2是NR1的調(diào)節(jié)亞單位，多數(shù)研究認(rèn)為含有NR2A的NMDA受體主要在缺血耐受機(jī)制中發(fā)揮保護(hù)作用，而含有NR2B的NMDA受體及其介導(dǎo)的信號(hào)分子在興奮性毒性和缺血引起的神經(jīng)元死亡中起主要作用［5，8］。在本實(shí)驗(yàn)中，NR2B 蛋白表達(dá)在腦缺血再灌注損傷后6 h即出現(xiàn)顯著下調(diào)，則從另一個(gè)角度證實(shí)了NR2B的表達(dá)降低可能是引發(fā)大腦皮質(zhì)病理學(xué)改變的始動(dòng)因素;而此后NR2A/2B的不均衡下調(diào)，導(dǎo)致NR2A的保護(hù)性調(diào)控作用降低、NR2B的損傷性調(diào)控作用增強(qiáng)，進(jìn)而加重NMDA受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能改變，則可能是進(jìn)一步引發(fā)大腦皮質(zhì)病理學(xué)改變的繼發(fā)原因。再灌注24 h后NR2A/2B的表達(dá)開始上調(diào)，再灌注96 h時(shí)，不管基因水平NR2A∶NR2B約為1∶1，蛋白的表達(dá)量已接近正常水平，說明NR2A和NR2B分別作為NMDA復(fù)合體中參與保護(hù)和損傷的重要調(diào)節(jié)亞單位，隨著再灌注時(shí)間的延長它們能通過自身的調(diào)節(jié)達(dá)到與正常水平相似的平衡狀態(tài)，這可能是大鼠自身在腦缺血再灌注損傷中的應(yīng)激性保護(hù)。這種上調(diào)性保護(hù)與Liu等［4］報(bào)道的NMDA受體過度表達(dá)參與腦缺血再灌注損傷的興奮性氨基酸毒性損傷并不矛盾，因?yàn)樵俟嘧?6 h NR2A/2B的表達(dá)仍低于正常水平。需要說明的是，RNA和蛋白具體表達(dá)量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不盡一致，這是由于蛋白表達(dá)可以受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，也可以受翻譯水平的調(diào)控，而翻譯水平的調(diào)控可以導(dǎo)致蛋白表達(dá)和RNA水平不成比例［9］。

目前臨床多選用氯胺酮、美金剛等非競爭性NMDA受體拮抗劑治療IRI，但均難以達(dá)到理想效果，甚至加重腦病理損傷的發(fā)生［10-11］。究其原因，主要在于上述藥物均為非受體亞型選擇性NMDA受體拮抗劑;且在使用過程中，未重點(diǎn)考慮NR2不同亞型在損傷后不同時(shí)間表達(dá)變化。而本研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)，NMDA受體亞單位在IRI發(fā)作過程中，其表達(dá)存在亞單位特異性。因此，依據(jù)NR2A/2B在腦缺血再灌注后不同時(shí)間表達(dá)變化，選用相應(yīng)的NR2受體亞單位激動(dòng)劑或拮抗劑進(jìn)行選擇性治療，將成為今后IRI的治療新方向。

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