宋 瑩，王洪新，張 晶，喻曉春，魯美麗，趙素玲，周振華

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥物研究所心腦血管藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州 121001;2.中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

心肌肥厚發(fā)生過程中，心肌細(xì)胞能量代謝異常，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)的β氧化能力降低，細(xì)胞的葡萄糖攝取和酵解能力提高，造成FFA和糖酵解產(chǎn)物乳酸(lactic acid，LAC)積累、胞質(zhì)酸化、線粒體功能降低和膜脆化，從而導(dǎo)致心肌肥厚和心衰［1］。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黃芪的主要成分之一，由APSⅠ和Ⅱ組成;APSⅠ是雜多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖組成;APSⅡ?yàn)槠暇厶牵搔?(1→4)-D-糖苷鍵連接而成［2］。APS 具有提高免疫力、抗氧化［3］、抗自由基和降血糖血脂等［4］藥理作用，對(duì)體外血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大有一定的抑制作用［5］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察 APS對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄(abdominal aorta construction，AAC)致大鼠心肌肥厚、心肌結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞能量代謝及細(xì)胞線粒體功能的影響，探討APS對(duì)心肌肥厚影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

APS(陜西森弗生物技術(shù)有限公司)，批號(hào):HQ090312，純度98%。LAC測(cè)定試劑盒，F(xiàn)FA測(cè)定試劑盒，總蛋白測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)(南京建成生物工程研究所)。線粒體膜電位測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。RT-PCR所用試劑(大連寶生物公司)。TC-512型梯度PCR分析儀(英國Techine公司)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。Leica sp5型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 動(dòng)物、模型制備及分組

SD大鼠60只，清潔級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量180～200 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003-0007。取大鼠48只，參照文獻(xiàn)［6］，采用結(jié)扎大鼠腹主動(dòng)脈制備心肌肥厚模型。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，ip給予水合氯醛3 mg·kg－1麻醉后，右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，分離暴露左腎動(dòng)脈上方腹主動(dòng)脈，用針尖磨鈍的8號(hào)注射針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后小心拔出針頭，造成腹主動(dòng)脈部分狹窄;手術(shù)動(dòng)物分為4組:AAC 模型組，APS200，400 和800 mg·kg－1組。另取12只假手術(shù)對(duì)照組僅分離腹主動(dòng)脈不行縮窄術(shù)。手術(shù)后1周APS組開始ig給藥，AAC組及假手術(shù)組ig給予同等容量?jī)羲B續(xù)11周。

1.3 監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

大鼠禁食12 h后稱取體質(zhì)量(body mass，BM)，用水合氯醛3 mg·kg－1麻醉，用 BL.420型四道生理記錄儀測(cè)定大鼠的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大升降速率(maximum rate of rise/decrease of LVSP，±d p/d tmax)。

1.4 心肌肥厚指數(shù)的測(cè)定

麻醉開胸取心臟，稱全心濕重(heart mass，HM)和左心室濕重(left ventricle wet mass，LVM)，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI)=HM/BM(mg·g－1)，左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)=LWH/BM(mg·g－1)。

1.5 HE染色檢測(cè)心肌組織改變

取心尖組織迅速固定于4%甲醛中，石蠟包埋。石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5μm，切片常規(guī)脫蠟脫水，做常規(guī)HE染色。

1.6 測(cè)定心肌生化指標(biāo)

取心尖組織100 mg，置入含0.9%生理鹽水0.9 ml的試管中，用勻漿器勻漿，得到組織勻漿。取心肌組織勻漿按試劑盒方法測(cè)定心肌FFA和LAC，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定心肌總蛋白。

1.7 RT-PCR測(cè)定心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA 表達(dá)

取約100 mg大鼠心臟組織放于玻璃研磨器內(nèi)，加入Trizol溶液，按試劑盒要求操作，提取總RNA。取約1μg總 RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為:42℃ 60 min，99℃ 2 min，4℃保存。ANP 的引物序列(5'－3')為GGCTCCTTCTCCATCACCAA TGT TAT CTT CGG TAC CG，內(nèi)參 GAPDH的引物序列(5'－3')為CAA AGT TGT CAT GGA TGA CCA TGG AGA AGG CTGGG。上述引物由北京奧科生物有限公司合成，滅菌水溶解并配制成100μmol·L－1的上下游引物混合液，使用濃度為20μmol·L－1。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸 72℃ 45s，終末延伸 72℃ 5 min，4℃終止，32循環(huán)。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，取6μl產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件GENETOOLS對(duì)RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行密度分析，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)ANP和 GAPDH密度分析結(jié)果比值，計(jì)算得到ANP的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 心肌細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的測(cè)定

按照文獻(xiàn)［7－8］方法制備肥厚心肌的單個(gè)心室肌細(xì)胞 。取(1～6)×105細(xì)胞，重懸于0.5 ml KB 液〔mmol·L－1:L-谷氨酸 70，牛磺酸 20，KCl 40，EGTA 0.5，KH2PO420，MgCl23，葡萄糖10，HEPES 10，KOH 70)中保存。加入0.5 ml JC-1(5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基苯咪羰花青碘化物)染色工作液，混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。參照說明書按試劑盒要求操作，最后用適量JC-1染色緩沖液重懸。用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)JC-1單體時(shí)把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm，得到綠色熒光圖像;檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm，觀察得到紅色熒光圖像。以紅色和綠色熒光強(qiáng)度的比值表示 MMP［9－10］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)心肌肥厚大鼠心臟指數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠HMI和LVMI明顯增加(P＜0.01)，表明大鼠已出現(xiàn)心臟功能障礙。與AAC模型組相比，APS 200，400 和800 mg·kg－1組大鼠 HMI和 LVMI明顯降低(P＜0.05，P ＜0.01)，說明 APS可有效減輕AAC所致的心肌肥厚。

Tab.1 Effect of Astragalus polysaccharide(APS)on heart mass index(HMI)and left ventricular mass index(LVMI)in abdominal aorta constriction(AAC)rats

2.2 APS對(duì)心肌肥厚大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠 LVSP，LVEDP和 ±d p/d tmax明顯增加(P＜0.05)。與 AAC 模型組相比，APS 800 mg·kg－1組大鼠LVEDP和 ±d p/d tmax明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，APS 400 mg·kg－1LVSP 和 +d p/d tmax明顯降低(P ＜0.05)，APS 200 mg·kg－1組無明顯改變。

2.3 APS對(duì)心肌肥厚大鼠心肌病理變化的影響

Fig.1 Effect of APSon myocardial tissue pathogenic changes of AAC rats(×200).A:sham group;B:AAC model group;C:model+APS 200 mg·kg－1;D:model+APS 400 mg·kg－1;E:model+APS800 mg·kg－1.

由圖1可見，HE染色光鏡下假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊(圖1A);AAC模型組心肌纖維束較寬大，肌纖維間隙疏松水腫，間隙增寬，心肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維增粗肥大，組織中可見炎癥細(xì)胞浸潤間質(zhì)增大(圖 1B)。APS 400 mg·kg－1(圖1D)和800 mg·kg－1(圖1E)組病理變化與AAC模型組相比明顯改善，心肌纖維束縮小，間隙變窄，心肌細(xì)胞排列較整齊，組織中炎癥細(xì)胞浸潤間質(zhì)變小。

2.4 APS對(duì)心肌肥厚大鼠 ANP mRNA表達(dá)的影響

如圖2和表3所示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組 ANP mRNA的表達(dá)增加，為假手術(shù)組的3.4倍(P＜0.01)。與模型組相比，APS 400 和800 mg·kg－1組ANP mRNA 表達(dá)明顯下降，分別下降了58%和70%(P＜0.05)。表明APS可以抑制AAC致肥厚心肌ANP mRNA表達(dá)。

Fig.2 Effect of APS on atrial natriuretic peptide(ANP)mRNA level in AAC rats by RT-PCR.See Tab.1 for the legend.±s，n=5.Lane 1:sham group;lane 2:AAC model group;lane 3:model+APS 200 mg·kg－1;lane 4:model+APS 400 mg·kg －1;and 5:model+APS 800 mg·kg －1.

Tab.3 Effect of APSon mRNA level of ANP

Tab.2 Effect of APS on hemodynamic paramerters in AAC rats

2.5 APS對(duì)心肌肥厚大鼠左心室肌組織LAC和FFA含量的影響

表4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠左心室肌組織LAC含量是假手術(shù)組的1.38倍(P＜0.01)。與模型組相比，APS 200，400 和800 mg·kg－1組 LAC 水平明顯降低(P ＜0.05);APS 800 mg·kg－1組與假手術(shù)組水平相當(dāng)。與假手術(shù)組相比，AAC模型組大鼠左心室肌組織的FFA含量顯著升高，是假手術(shù)組的1.67倍。APS 200，400和800 mg·kg－1組可顯著降低左心室肌組織FFA的含量(P ＜0.01)。

Tab.4 Effect of APSon contents of lactic acid(LAC)and free fatty acids(FFA)in AAC rats

2.6 APS對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位影響

表5和圖3顯示，與假手術(shù)組相比，AAC模型組MMP顯著降低(P＜0.01);與AAC模型組相比，APS400和 800 mg·kg－1組 MMP顯著增高(P＜0.01)，APS 200 mg·kg－1組差異不顯著。

Tab.5 Effect of APS on mitochondrial membrane potential(MMP)in AAC rats

Fig.3 Effect of APSon mitochondrial membrane potential(MMP)of hypertrophic cardiomyocytes induced by AAC in rats.A:The red color shows the expression of MMP at λem=530 nm.B:The green color shows the expression of MMP atλem=590 nm.See Tab.1 for the legend.±s，n=5.1.sham group;2.AAC model group;3.model+APS 200 mg·kg－1;4.model+APS 400 mg·kg－1;5.model+APS 800 mg·kg－1.

3 討論

心肌肥厚是多種心血管病的共同病理過程，也是心力衰竭發(fā)生的結(jié)果。腹主動(dòng)脈狹窄是由手術(shù)阻礙心臟射血的后負(fù)荷增大，以后心臟出現(xiàn)的代償反應(yīng)，導(dǎo)致心肌肥厚。ANP的合成和釋放增加是心肌肥厚、心肌細(xì)胞增大的一個(gè)標(biāo)志性變化。12周時(shí)測(cè)定HMI和LVMI較正常對(duì)照組明顯升高，ANP的mRNA表達(dá)顯著增高，表明此時(shí)大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心肌肥厚，主要是左心室肥厚。大鼠腹主動(dòng)脈縮窄后，機(jī)體為適應(yīng)心臟后負(fù)荷明顯增加，增高交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，此時(shí)心臟工作效率基本正常，處于心功能代償期，在體觀察表現(xiàn)為左心室收縮功能增強(qiáng)而舒張功能明顯下降［11］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予APS處理后，大鼠HMI和LVMI明顯低于AAC模型組，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相對(duì)于AAC模型組明顯改善，ANP的mRNA表達(dá)顯著低于模型組，證明APS具有抑制腹主動(dòng)脈狹窄大鼠心肌肥厚的作用。

在心肌肥厚發(fā)生過程中，心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生機(jī)制由正常情況下以脂肪酸氧化供能為主轉(zhuǎn)而更多地依賴于葡萄糖氧化和酵解［12］。這些現(xiàn)象提示心肌肥厚發(fā)生中存在能量供應(yīng)過分緊張的狀態(tài)。產(chǎn)能機(jī)制的變化使FFA和葡萄糖酵解產(chǎn)物L(fēng)AC的堆積在心肌肥厚中突出表現(xiàn)出來，引起胞質(zhì)酸化導(dǎo)致線粒體膜脆化。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定心肌FFA的含量，我們觀察到AAC模型組的心肌FFA含量遠(yuǎn)高于假手術(shù)組，證明了之前對(duì)心肌肥厚FFA堆積的說法成立。另外AAC模型組的心肌LAC含量增高也可進(jìn)一步說明心肌肥厚細(xì)胞產(chǎn)能機(jī)制由有氧氧化向無氧酵解轉(zhuǎn)化，能量底物從以脂肪酸為主逐漸地更多轉(zhuǎn)向葡萄糖;但葡萄糖產(chǎn)能的效率較脂肪酸低，導(dǎo)致心肌處于“能量饑餓狀態(tài)”，造成了LAC含量過高［13］。對(duì)于APS組FFA和LAC的含量降低，由此推測(cè)APS可能通過回復(fù)正常心肌細(xì)胞產(chǎn)能機(jī)制的調(diào)節(jié)來抑制心肌肥厚。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所。MMP是反映線粒體功能的重要生物能量學(xué)參數(shù)，其電位值大小可以直接反映線粒體功能的變化。MMP是線粒體保持穩(wěn)定的重要條件，當(dāng)線粒體膜完整性遭到破壞時(shí)，MMP下降，線粒體氧化磷酸化功能障礙，呼吸鏈解偶聯(lián)，最終可導(dǎo)致細(xì)胞能量產(chǎn)生異常、凋亡或壞死。研究表明，F(xiàn)FA和LAC的堆積胞質(zhì)酸化，線粒體膜兩側(cè)的pH梯度和電位梯度變化，使膜電位發(fā)生變化［14－15］，同時(shí)線粒體膜完整性遭到破壞，最終可導(dǎo)致細(xì)胞能量產(chǎn)生異常、凋亡或壞死。本實(shí)驗(yàn)建立的AAC心肌肥大模型組的MMP明顯低于假手術(shù)組，經(jīng)過APS處理后MMP明顯增高。提示APS能夠通過提高M(jìn)MP，對(duì)線粒體具有一定的保護(hù)作用，提高線粒體的活力。

綜上所述，APS能夠有效抑制AAC模型大鼠心肌肥厚，其機(jī)制可能與改善心肌能量FFA和LAC代謝紊亂和提高線粒體的活力有關(guān)，這為臨床防治心肌肥厚提供新的思路。然而，APS是如何作用致FFA和LAC減少以達(dá)到保護(hù)線粒體的目的的具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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