馬慶陽，楊俊卿，羅 文，羅 映，余華榮

(重慶醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，重慶 410016)

目前治療抑郁癥的針對性藥物主要以5-羥色胺(serotonin，5-HT)再攝取抑制劑和去甲腎上腺素(noradrenalin，NA)再攝取抑制劑為主。近年來中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激和炎癥反應與抑郁發(fā)生發(fā)展的關系備受關注。5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LO)是催化花生四烯酸生成白三烯類(leukotrienes，LTs)的關鍵酶，LTs參與了神經(jīng)中樞與外周炎癥反應過程，在氧化應激過程中舉足輕重。5-LO抑制劑咖啡酸通過抑制5-LO的激活，抑制LTs的生成，減輕氧化應激損傷，對大鼠海馬等組織損傷有明顯保護作用［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸對神經(jīng)元退行性病變有良好的保護作用［2］。Takeda 等［3－4］通過分析咖啡酸對強迫游泳致急性抑郁模型和冰水刺激致急性抑郁模型的行為學作用，預測咖啡酸可能有一定的抗抑郁作用。急性抑郁模型僅是模擬短時的抑郁狀態(tài)，Takeda等也僅是提出咖啡酸抗抑郁作用可能與其抗氧化應激作用有關的初步設想。本實驗通過模擬各種慢性不可預見性輕度刺激，建立大鼠抑郁狀態(tài)模型，觀察5-LO抑制劑咖啡酸對大鼠抑郁狀態(tài)的作用，并從氧化應激初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

咖啡酸(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，批號:ZL1006010;鹽酸舍曲林(四川省百草生物藥業(yè)有限公司)，批號:090202;測總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號:20110221;丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，批號:20110223;雙縮脲法總蛋白測試盒，批號:20101110(均南京建成生物技術有限公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

自制曠場行為測試儀(100 cm×100 cm×50 cm木箱，內(nèi)壁與底面漆成黑色，底面分為5×5個正方小格);自制強迫游泳行為測試儀〔高50 cm，直徑30 cm，其內(nèi)水深30 cm，水溫24～26℃〕;恒溫水浴鍋;UV-3150紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

1.3 動物、慢性輕度不可預見應激大鼠抑郁模型建立及分組

清潔級雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(渝)2007-0001。在實驗條件下飼養(yǎng)7 d以適應實驗環(huán)境，在此期間進行撫摸以適應實驗員的操作。造模前自由飲食飲水，室溫22～24℃，濕度40% ～70%，光暗周期12 h∶12 h。

60只SD大鼠隨機分為6組，每組10只，參考慢性不可預知的溫和型應急模型和孤養(yǎng)模型并加以改進［5］(后均稱慢性應激)。正常對照組大鼠采用大籠飼養(yǎng)，每籠5只，正常進食飲水，不給予任何刺激。其他5組大鼠每籠1只孤養(yǎng)，并接受21 d應激刺激，刺激包括:冰水游泳(4～5℃，5 min)、熱水游泳(40℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、禁水食(24 h)、潮濕墊料(將水加入干凈木屑，充分混合直至潮濕后替換鼠籠內(nèi)干燥墊料)、束縛(自制束縛桶，塑料做成，長20 cm，直徑10 cm，頭為直徑4 cm的出氣孔，中干及尾部直徑8 cm，尾部可開合，4 h)、晝夜顛倒(24 h)、異物刺激(經(jīng)消毒后3 cm×3 cm布條或石塊)和噪聲刺激(1500 Hz，92 dB，1 h)，實驗在重慶醫(yī)科大學動物實驗中心功能實驗室進行。每日隨機給予一種刺激，3 d內(nèi)不重復。21 d后，按照分組，分別ig給予生理鹽水、舍曲林5 mg·kg－1和咖啡酸10，30 和50 mg·kg－1，連續(xù)21 d。

1.4 曠場行為觀察

參照許晶等［6］所使用的曠場實驗方法，給藥21 d后進行曠場(open-field test)行為觀察。在可見度5 m的黑暗情況下，將大鼠放在正中央格，觀察5 min內(nèi)活動情況。以動物穿越底面方塊數(shù)為水平活動(crossing)得分，以直立次數(shù)為垂直活動(rearing)得分，以初次在中央格停留時間為潛伏期(latent time)。每只大鼠實驗結束后對曠場行為測試儀進行徹底清潔。

1.5 強迫游泳觀察

給藥21 d后，參照Cryan等［7］所改良的強迫游泳實驗方法并作改進后進行強迫游泳(forced swimming)行為觀察。將大鼠放入水池，記錄300 s內(nèi)每10 s末大鼠行為(包括攀爬行為、游泳行為和靜止不動行為)。攀爬行為指大鼠在泳池中沿著泳池內(nèi)壁使用前爪向上攀爬的行為;游泳行為指大鼠在泳池內(nèi)水平面上以及泳池內(nèi)四周游動;靜止不動行為指大鼠除了為避免沒入水中而向上的主動運動外，無其他行為。實驗結果以靜止不動行為所占百分比(percentage of immobility，PI)表示。

1.6 海馬SOD活性和MDA含量的測定

行為學觀察結束后，每組各取4只大鼠，斷頭后分離全腦，并在冰面上快速分離出海馬，用冰生理鹽水制成10 g·L－1勻漿。以黃嘌呤酶法測定SOD活性，以硫代巴比妥酸法測定MDA含量。蛋白質含量采用雙縮脲法。具體操作按照SOD和MDA試劑盒說明書要求進行。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 咖啡酸對慢性應激大鼠的曠場行為的影響

表1結果顯示，曠場行為測試發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，慢性應激模型組中央格停留時間顯著增加(P＜0.01)，水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)顯著降低(P＜0.01)。與慢性應激模型組相比，舍曲林5 mg·kg－1組的中央格停留時間顯著縮短(P ＜0.01)，水平活動次數(shù)顯著增多(P＜0.01)，而垂直活動情況無顯著差異?？Х人?～50 mg·kg－1組大鼠組中央格停留時間均顯著縮短(P＜0.01)，水平活動次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，垂直活動無顯著差異。

Tab.1 Effect of caffeic acid on latent time，rearing and crossing in open-field test in chronic mild unpredictable stress rats

2.2 咖啡酸對慢性應激大鼠強迫游泳行為的影響

強迫游泳實驗表明，與正常對照組相比，慢性應激模型組大鼠靜止不動行為顯著增加(P＜0.01)。與慢性應激模型組相比，舍曲林5 mg·kg－1組的靜止時間顯著縮短(P＜0.01)?？Х人?10～50 mg·kg－1能顯著縮短抑郁大鼠靜止不動時間，且呈劑量依賴性(r=0.985，P ＜0.01)(表2)。

Tab.2 Effect of caffeic acid on percentage of immobility(PI)in depressive rats

2.3 咖啡酸對慢性應激大鼠海馬組織SOD活性及MDA含量的影響

表3結果顯示，與正常對照組比較，慢性應激模型組大鼠海馬SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P＜0.01)。與慢性應激模型組相比，舍曲林能夠顯著升高大鼠海馬SOD活性，降低MDA含量(P ＜0.01);咖啡酸 10 ～50 mg·kg－1也能劑量依賴性地顯著提高 SOD 活性(r=0.926，P ＜0.01)，和降低 MDA 含量(r=0.982，P ＜0.01)。

Tab.3 Effect of caffeic acid on superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content in depressive rats

3 討論

慢性應激可以引起人類及動物的下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸功能亢進，進而出現(xiàn)抑郁狀態(tài)［7］，本實驗所建立模型是目前國內(nèi)外學者研究抑郁發(fā)病機制和抗抑郁藥物的主要模型之一。曠場行為測試可模擬抑郁患者行動力下降、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制的狀況。本研究使用改良后的強迫游泳實驗，采用盲法檢測大鼠5 min內(nèi)每10 s末3種行為出現(xiàn)的頻率，通過本實驗室前期研究對比發(fā)現(xiàn)，此方法與 Cryan等［7］提出的每5 s末檢測一次的方法結果無顯著差異，有一定可靠性和可行性;本實驗中大鼠處于不動狀態(tài)時間增長，在一定程度上模擬了抑郁患者“行為絕望”的狀態(tài)，近似于情緒低落所表現(xiàn)的情況［8］。

本實驗所采用的咖啡酸給藥劑量參照公認大鼠5-LO 抑制劑的使用劑量(10 ～ 50 mg·kg－1)［9－10］。ig給予咖啡酸后，慢性應激大鼠在曠場中央格的停留時間顯著縮短，水平活動情況顯著增加，并在強迫游泳實驗中靜止不動狀態(tài)減少，且呈劑量依賴性，表明咖啡酸對大鼠抑郁行為有明顯的改善作用，與Takeda等［3－4］采用強迫游泳和電刺激造成急性抑郁癥治療作用相似。研究證實抑郁患者記憶能力會伴隨治療得到恢復［11］。本研究顯示，ig給予咖啡酸后，海馬氧化應激情況改善，說明咖啡酸的抗抑郁作用與氧化應激有關?？Х人嵬ㄟ^抑制5-LO激活，使海馬花生四烯酸代謝減慢，LTs釋放減少，而LTC4，LTD4和LTE4可與體內(nèi)一些重要受體結合，誘導海馬氧化應激反應的發(fā)生;因此，5-LO激活被抑制必然導致海馬氧化應激反應減弱，使得體內(nèi)調控氧化反應的主要活性酶之一——SOD活性升高，從而使海馬損傷減輕，表現(xiàn)為MDA含量明顯降低［12］。由此可見，咖啡酸具有修復抑郁狀態(tài)所致海馬損傷的作用。但是，抑郁狀態(tài)與腦內(nèi)許多區(qū)域有關，咖啡酸除了對抑郁海馬的損傷修復外，對于其他部位的損傷是否具有修復作用需要進一步深入研究。

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