陳振華

湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，湖北荊州434020

羊快疫是由梭狀芽孢桿菌屬的腐敗梭菌引起的主要危害綿羊的一種急性、致死性傳染病，該病以發(fā)病突然、病程短及病羊真胃黏膜呈出血性壞死性炎癥為特征［1-2］。腐敗梭菌兩端鈍圓、革蘭氏染色呈陽性，在肝臟漿膜上可形成階段不明顯的微彎曲的長絲狀或階段明顯的鏈條狀菌落，幼齡菌體有鞭毛、無莢膜，可形成芽孢［3］。腐敗梭菌常以芽孢形式分布于低洼草地、熟耕地及沼澤中，羊采食了被污染的飼料和飲水后，芽孢隨之進入羊的消化道，當羊受到不良因素刺激致使機體抵抗力下降時，腐敗梭菌就會大量繁殖，產(chǎn)生外毒素，損害羊只消化道黏膜，引起中毒性休克，使羊迅速死亡［4］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用病料為疑似羊快疫病羊的肺組織，由長江大學生命科學學院生物實驗室熊濤老師提供。

1.2 病料鏡檢

無菌取病料，涂片后進行革蘭氏染色，并用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.3 細菌的分離

用接種環(huán)無菌挑取病料，采用分區(qū)劃線的方法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

1.4 分離細菌的培養(yǎng)特性研究

將厭氧肉肝湯培養(yǎng)基煮沸5min，隨即置冷水中冷卻，以排出培養(yǎng)基內(nèi)的空氣；接種前，先將液面石蠟處的管壁外部在酒精燈火焰上略烤，使石蠟與管壁分離；然后挑取單個菌落從石蠟與管壁間的空隙處插入培養(yǎng)基中；接種完后，將液面的石蠟烤融，使其平整地覆蓋液面，然后將其置于試管架上冷卻至石蠟?zāi)毯?，?7℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.5 分離細菌的生化鑒定

1）糖發(fā)酵試驗。取用于糖發(fā)酵試驗的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘露糖6支生化管，挑取分離菌的單菌落分別接種于上述生化管中，37℃培養(yǎng)2～3d，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變?yōu)辄S色的為產(chǎn)酸，倒置的德漢氏小管內(nèi)有氣泡的為產(chǎn)氣。

2）過氧化氫酶試驗。用接種環(huán)挑取分離菌的單菌落，置于潔凈試管內(nèi)，然后滴加3%過氧化氫溶液10mL，觀察結(jié)果。0．5min內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

3）靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）。取用于做靛基質(zhì)試驗的生化管2支，挑取分離菌的單菌落對其中1支進行接種，另1支作為對照；37℃培養(yǎng)2d；然后于每管各加入乙醚3～4滴，搖動數(shù)次，靜置1～3min；待乙醚上升后，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑2滴，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物者為陽性反應(yīng)。

4）甲基紅試驗。取用于做甲基紅試驗的生化管2支，分別挑取分離菌的單菌落進行接種，37℃培養(yǎng)2d，然后在其中1支試管中加入甲基紅試劑2滴，另1支作為對照。培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變黃色者為陰性。

5）明膠液化試驗。取用于做明膠液化試驗的生化管2支，用接種針挑取分離菌的單菌落對其中1支進行穿刺接種，另1支作為對照；然后將2支生化管于20℃培養(yǎng)2～5d。由于明膠在20℃下為液態(tài)，所以觀察時需冰浴一段時間，若在冰浴后仍為液體，則說明該菌對明膠有液化作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料涂片染色特性

鏡檢可見菌體兩端鈍圓，為單個或短鏈的桿狀菌，有的數(shù)個連接在一起形成長短不等的長絲狀，如圖1所示。

圖1 病料涂片的革蘭氏染色結(jié)果

2.2 細菌的分離培養(yǎng)

病料中的病原菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成薄沙狀菌落群，菌落微隆起、邊緣厚薄不均、呈淡灰色，如圖2所示。

圖2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離的菌株

2.3 分離菌的培養(yǎng)特性

用厭氧肉肝湯培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌，可見肉湯變混濁，管底形成大量絮片狀白色沉淀（如圖3所示），有類似脂肪腐敗的氣味。

2.4 分離菌的生化鑒定試驗

該批分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖和乳糖，且產(chǎn)酸、產(chǎn)氣；不發(fā)酵甘露糖和蔗糖。該批分離菌的過氧化氫酶試驗結(jié)果為陰性，靛基質(zhì)試驗結(jié)果為陰性，甲基紅試驗結(jié)果為陽性，可以液化明膠。具體結(jié)果如圖4～8所示。

圖5 分離菌的過氧化氫酶試驗結(jié)果（左為過氧化氫，右為接種后的過氧化氫）

圖6 靛基質(zhì)試驗結(jié)果（左為無菌加指示劑，右為有菌加指示劑）

圖7 甲基紅試驗結(jié)果（左為含菌未加指示劑，右為含菌加指示劑）

圖8 明膠液化試驗結(jié)果（左為不含菌，右為含菌）

綜合分離菌的染色特性、培養(yǎng)特性及生化鑒定結(jié)果，可確定病料中病原菌為專性厭氧的腐敗梭菌。

3 討 論

本試驗使用普通的培養(yǎng)基和簡易的厭氧培養(yǎng)方法，成功分離出了病料中專性厭氧的腐敗梭菌，簡化了培養(yǎng)過程，確定了病料來源羊只所患疫病為羊快疫，為治療其它羊只提供了較好的依據(jù)。

［1］ 鄺泳娟．深圳市豬弓形體病的調(diào)查與防治［J］．中國獸醫(yī)科技，2002，2（12）：37-38．

［2］ 趙中興，范鋒，周永華，等．無錫地區(qū)豬弓形體感染血清學調(diào)查［J］．中國血吸蟲病防治雜志，2003，15（6）：417-421．

［3］ 陸艷，李曉卉．青海省弓形體病流行病學調(diào)查［J］．中國獸醫(yī)雜志，2005（2）：30．

［4］ 張能貴，劉慶龍，范永嬋，等．上杭縣豬弓形體病的血清學調(diào)查［J］．福建畜牧獸醫(yī)，2006，28（1）：34．