張海波，余加林，艾 青，徐艷珍

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學(xué)重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地 400014）

中國是剖宮產(chǎn)率最高的國家，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的調(diào)查顯示中國的剖宮產(chǎn)率達46%，遠高于15%的世界平均水平[1－2]。剖宮產(chǎn)不僅帶來了高昂醫(yī)療費用，而且對新生兒未來的健康帶來很大的影響[3]。大量研究表明，新生兒胃腸道最初定植的細菌在機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。腸道最初定植菌的刺激作用促進了新生兒免疫器官的發(fā)育成熟，并產(chǎn)生了多種保護性抗體[4－5]。研究發(fā)現(xiàn)許多過敏性疾病與腸道微生態(tài)最初建立時的失調(diào)有關(guān)[6]。本研究應(yīng)用16SrRNA／DNA結(jié)合real－time PCR技術(shù)對配方奶喂養(yǎng)的新生兒生后前3 d內(nèi)的腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌進行了定量分析，以探討剖宮產(chǎn)對新生兒腸道菌群定植的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年12月1日至2011年1月15日在重慶市婦幼保健醫(yī)院出生的83例健康足月新生兒為研究對象（均為配方奶喂養(yǎng)）。其中，剖宮產(chǎn)組（n＝40），自然分娩組（n＝39）。納入標準：健康足月新生兒，胎齡37～＜42周，體質(zhì)量2 500～4 000 g，出生后沒有使用任何抗生素和微生態(tài)制劑，沒有腹瀉等感染性疾病。其母在分娩前2周內(nèi)沒有使用抗生素，沒有患腸道、生殖道等感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有納入標準的新生兒均收集其出生后3 d內(nèi)的糞便樣本。具體操作：用收集管的小匙刮取尿不濕上的新鮮糞便，放入收集管，然后放在裝有冰塊的保溫壺中，6～12 h后分裝在無菌的1.5mL EP管中，放置在－70℃的冰箱中保存以備用。

1.2.2 糞便樣本細菌DNA的提取 使用QIAamp DNA mini kits（Qiagen，Hilden）提取糞便樣本內(nèi)的細菌基因組DNA，具體操作按照說明書進行。提取的細菌基因組DNA放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計及合成 從GenBank中分別獲取雙歧桿菌和乳酸桿菌各菌種的序列，根據(jù)細菌的16sr RNA／DNA特異性基因序列，設(shè)計雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬特異性引物，并在BLAST基因庫（www.nebi.nlm.gov／BLAST）中進行比對，驗證其特異性[7]。所有引物均由上海生工公司合成。見表1。

表1 PCR特異性引物

1.2.4 質(zhì)粒標準品的制備

1.2.4.1 標準菌株的培養(yǎng)和細菌DNA的提取 雙歧桿菌標準菌株（兩歧雙歧桿菌6174）由重慶醫(yī)科大學(xué)微生物實驗室惠贈，乳酸桿菌標準菌株（嗜酸乳桿菌6005）購于廣微菌庫。雙歧桿菌和乳酸桿菌用MRS培養(yǎng)基在裝有混合氣體（80%N2，10%H2，10%CO2）的厭氧罐中37℃培養(yǎng)48 h后提取細菌DNA。細菌DNA的提取采用天根公司的“細菌基因組DNA提取試劑盒”，操作按照說明書。

1.2.4.2 16Sr DNA PCR擴增及其反應(yīng)條件 以兩種細菌的基因組DNA為模板，應(yīng)用上述相應(yīng)的引物進行50μL體系的PCR反應(yīng)。所用試劑盒為：PCR Premix Taq（D334A，Ta Ka－Ra），反應(yīng)條件：94℃5 min，35個循環(huán)（94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。PCR產(chǎn)物均進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4.3 PCR產(chǎn)物純化及TA克隆 兩種細菌的16Sr DNAPCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，產(chǎn)物用PMD18－T Vector（Ta Ka－Ra）試劑盒進行克隆。克隆產(chǎn)物均勻涂在X－Gal－IPTG－Amp－LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h。

1.2.5 質(zhì)粒的培養(yǎng)和鑒定 挑取培養(yǎng)皿上的白色單菌落放入10 mL含有10μL Amp的LB培養(yǎng)基中，在37℃，200轉(zhuǎn)／分，的搖床上振蕩培養(yǎng)18 h。取2 mL菌液用MiniBEST Plasmid Purification Kit（Ta KaRa）提取質(zhì)粒DNA，進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接情況。如果有目的條帶，則取500μL菌液加入等量30%的甘油，送上海生工公司測序以進一步鑒定。測序結(jié)果在BLAST基因庫（www.nebi.nlm.gov／BLAST）中進行比對，驗證其特異性。

1.2.6 標準曲線的建立及定量分析

1.2.6.1 標準質(zhì)?？截悢?shù)換算 據(jù)公式：拷貝數(shù)＝質(zhì)量數(shù)（g）×6.02×1 023／660×（2 692＋堿基對數(shù)），計算出每微升的質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)。然后，進行10倍體積梯度稀釋。具體方法：取2μL標準質(zhì)粒加入到198 mL dd H2O中充分混勻，形成10－2濃度梯度，取100μL該濃度梯度液加入到900μL dd H2O中形成10－3濃度梯度，以此類推直到形成10－7濃度梯度。

1.2.6.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件（所用試劑盒為SsoFast TM EvaGreen Supermix）反應(yīng)體系為10μL SYBR Green反應(yīng)體系，包括：Supermix 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA 1μL，dd H2O 2μL。經(jīng)優(yōu)化后的擴增條件為：雙歧桿菌質(zhì)粒：98℃2 min，40個循環(huán)包括（98℃2 s，57℃20 s，68℃10s），讀板。乳酸桿菌質(zhì)粒：98℃2 min，40個循環(huán)包括（98℃2 s，61℃10 s），讀板。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各菌群所測結(jié)果經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組之間差異比較采用獨立樣本的t檢驗，兩組內(nèi)相同菌種不同日齡之間兩兩比較用單因素的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

自然分娩組的新生兒在生后第1天腸道雙歧桿菌的數(shù)量與剖宮產(chǎn)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但出生后第2天、第3天則明顯高于同日齡的剖宮產(chǎn)組（P＜0.05）。在乳酸桿菌的檢測中，自然分娩組的新生兒腸道細菌的量均明顯高于剖宮產(chǎn)組的嬰兒（P＜0.05）。

表2 兩組新生兒不同日齡的糞便標本中雙歧桿菌和乳酸桿菌細菌數(shù)量的對數(shù)值（±s，lg copies／g）

表2 兩組新生兒不同日齡的糞便標本中雙歧桿菌和乳酸桿菌細菌數(shù)量的對數(shù)值（±s，lg copies／g）

菌種 日齡 自然分娩組（n＝39）剖宮產(chǎn)組（n＝44）tP雙歧桿菌 第1天5.69±0.75 5.65±0.64 0.191 0.849第2天 7.19±1.15 6.36±1.00 2.584 0.013第3天 7.49±1.29 6.69±1.06 2.066 0.046乳酸桿菌 第1天 5.88±0.41 4.66±0.73 6.556 0.000第2天 6.30±0.99 4.71±0.84 5.798 0.000第3天6.79±0.33 5.16±0.55 4.258 0.000

3 討 論

從出生開始，產(chǎn)生兒道經(jīng)歷了從無菌狀態(tài)到大量細菌定植的變化。但這一階段腸道菌群很不穩(wěn)定，易受到外界各種因素的影響而發(fā)生菌群失調(diào)。影響新生兒早期腸道菌群建立的因素主要有：分娩方式、喂養(yǎng)方式、胎齡、抗生素使用、環(huán)境衛(wèi)生和地域分布等[8]。母乳可以促進嬰兒腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長[9]，也有研究者認為剖宮產(chǎn)兒的產(chǎn)婦由于術(shù)中和術(shù)后大多使用抗生素，因此乳汁中含有的少量抗生素可能會進入嬰兒腸道，干擾嬰兒腸道雙歧桿菌的早期定植[10－11]。本研究中所選的研究對象為出生后3 d的足月產(chǎn)新生兒，且均為配方奶喂養(yǎng)，以排除喂養(yǎng)方式帶來的影響。與長期喂養(yǎng)相比，出生后3 d內(nèi)新生兒受喂養(yǎng)的影響相對較小，似乎更能反映出剖宮產(chǎn)可能帶來的影響。

在新生兒腸道中，最先定植的細菌通常是腸桿菌、腸球菌和葡萄球菌這樣的需氧菌和兼性厭氧菌。隨著這些細菌的生長消耗了腸道中的氧氣，降低了腸道中的氧化還原電位，為嚴格厭氧菌的定植創(chuàng)造了適合生存的環(huán)境。首次定植的嚴格厭氧菌包括雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌和脆弱桿菌。這類厭氧菌在生長過程中通過競爭底物和腸黏膜上的粘附位點，產(chǎn)生抑制需氧菌生長的代謝產(chǎn)物，降低腸道的p H值等使厭氧菌和需氧菌的比例逐漸增高，從而更加接近成人的腸道微生態(tài)特點[12]。

本研究結(jié)果表明，剖宮產(chǎn)對新生兒早期腸道微生態(tài)的定植產(chǎn)生了明顯的影響。相同時間內(nèi)，剖宮產(chǎn)分娩的新生兒腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯低于自然分娩的新生兒。這種差異可解釋為：自然分娩的新生兒分娩過程中容易接觸到母親產(chǎn)道，肛周及會陰部皮膚的細菌，并通過口腔吸入和肛門移入，定植在自身腸道中，這些細菌大部分是需氧菌，能很快消耗掉腸道中的氧氣和降低氧化還原電位，創(chuàng)造有利于厭氧菌生長的環(huán)境；而剖宮產(chǎn)的新生兒由于不經(jīng)過母親產(chǎn)道，并且手術(shù)過程中都經(jīng)過了嚴格消毒，減少了接觸母體細菌的機會，因此腸道最初定植的細菌可能多是來自于醫(yī)院環(huán)境的細菌，且定植延遲，因此不能很快消耗掉腸道中的氧氣，因此使雙歧桿菌和乳酸桿菌生長受到抑制。

值得注意的是許多研究報道，通過培養(yǎng)的方法對早期新生兒糞便中的菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)出生后前2 d，至少在出生后第1天內(nèi)新生兒腸道中均沒有發(fā)現(xiàn)有雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長[13－14]。但是，本研究結(jié)果卻表明新生兒在出生后4 h腸道中就能檢測出雙歧桿菌和乳酸桿菌。在第1天時，自然分娩的新生兒腸道雙歧桿菌的量略高于剖宮產(chǎn)的新生兒但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而且兩組中，雙歧桿菌和乳酸桿菌的絕對數(shù)量均較低?？赡艿脑颍海?）研究使用的方法不同。傳統(tǒng)的細菌定性和定量方法多采用培養(yǎng)和計數(shù)的方法，對于雙歧桿菌和乳酸桿菌這樣的厭氧菌培養(yǎng)相對困難，在早期即使有很少量的細菌生長也可能檢測不出來；本研究應(yīng)用分子生物學(xué)16Sr RNA／DNA結(jié)合real－time PCR技術(shù)對嬰兒腸道細菌進行絕對定量，全程操作均在相對封閉的PCR管中進行，受人為干擾的因素較小，并且檢測精度比培養(yǎng)方法明顯要高。（2）檢測到的可能是來自母體產(chǎn)道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌的DNA產(chǎn)物，而不是活菌內(nèi)的DNA。Satokar等[14]對新生兒胎盤上的雙歧桿菌和乳酸桿菌及其產(chǎn)物進行了研究，發(fā)現(xiàn)對胎盤組織進行選擇性培養(yǎng)沒有發(fā)現(xiàn)細菌生長，但是用細菌特異性引物對胎盤中的細菌DNA進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)絕大部分胎盤組織中都擴增出了雙歧桿菌和乳酸桿菌的DNA產(chǎn)物。

總之，本研究結(jié)果表明剖宮產(chǎn)改變了新生兒早期腸道菌群的正常定植，自然分娩的新生兒腸道早期定植的雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯比剖宮產(chǎn)兒高，因此自然分娩是最佳的分娩方式。

[1]Muula AS.Ethical and practical consideration of women choosing cesarean section deliveries without“medical indication”in developing countries[J].Croat Med J，2007，48（1）：94－102.

[2]張杏敏，鄭月紅.剖宮產(chǎn)率升高的因素分析與干預(yù)措施[J].中國婦幼保健，2011，26（29）：4488－4489.

[3]Vassallo MF，Walker WA.Neonatal microbial flora and disease outcome[J].Nestle Nutr Workshop Ser Pediatr Program，2008，61：211－224.

[4]Malamitsi－Puchner A，Protonotariou E，Boutsikou T，et al.The influence of the mode of delivery on circulating cytokine concentrations in the perinatal period[J].Early Hum Dev，2005，81（4）：387－392.

[5]Rook GA，Brunet LR.Microbes，immunoregulation，and the gut[J].Gut，2005，54（3）：317－320.

[6]Salam MT，Margolis HG，McConnell R，et al.Mode of delivery is associated with asthma and allergy occurrences in children[J].Ann Epidemiol，2006，16（5）：341－346.

[7]Delroisse JM，Boulvin AL，Parmentier I，et al.Quantification of Bifidobacterium spp.and Lactobacillus spp.in rat fecal samples by real－time PCR[J].Microbiol Res，2008，163（6）：663－670.

[8]Penders J，Thijs C，Vink C，et al.Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy[J].Pediatrics，2006，118（2）：511－21.

[9]張會豐，李根山，田秀巧，等.初乳對早期新生兒腸道菌群的作用[J].華人消化雜志，1998，6（8）：735.

[10]Jaureguy F，Carton M，Panel P，et al.Effects of intrapartum penicillin prophylaxis on intestinal bacterial colonization in infants[J].J Clin Microbiol，2004，42（11）：5184－5188.

[11]孫敬，陳會，鄧林強，等.母乳中抗生素對新生兒腸道正常菌群建立的影響[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗，2007，25（2）：116－118.

[12]Adlerberth I.Factors influencing the establishment of the intestinal microbiota in infancy[J].Nestle Nutr Workshop Ser Pediatr Program，2008，62：13－29.

[13]Sakata H，Yoshioka H，F(xiàn)ujita K.Development of the intestinal flora in very low birth weight infants compared to normal full－term newborns[J].Eur J Pediatr，1985，144（2）：186－90.

[14]Satokari R，Gronroos T，Laitinen K，et al.Bifidobacterium and Lactobacillus DNA in the human placenta[J].Lett Appl Microbiol，2009，48（1）：8－12.