鄧英光，張紫萍，余 衛(wèi)

腦梗死是常見病、多發(fā)病，提高患者生活質(zhì)量已成為醫(yī)學研究的重要課題。近年來隨著骨髓干細胞 (MSC)生物學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)某些MSC不但能再生其特定細胞，而且在一定環(huán)境下可轉(zhuǎn)變生成其他組織系統(tǒng)的細胞，這是20世紀末MSC領域的突破性進展之一［1］。我院神經(jīng)科從2008年9月開始，試用丹參聯(lián)合自體MSC移植，通過新生血管重建動脈側(cè)支循環(huán)和改善血流，修復缺血組織和損傷的神經(jīng)，從而緩解癱瘓肢體癥狀，改善腦梗死肢體癱瘓患者的不良預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院神經(jīng)內(nèi)科30例腦梗死肢體癱瘓患者。病例納入標準:(1)符合全國第四次腦血管會議制定的《腦血管疾病分類 (1995)》腦梗死的診斷標準［2］;(2)年齡18～80歲;(3)第1次患腦梗死發(fā)病3d內(nèi)入院，治療2～3周出院;(4)出院時無意識障礙，單側(cè)或雙側(cè)肢體肌力＞Ⅰ級，＜Ⅳ級。排除標準:(1)藥物過敏者;(2)有嚴重心、肝、腎等疾病者;(3)有嚴重精神障礙者;(4)難以隨訪者。

1.2 方法

1.2.1 分組 將30例腦梗死肢體癱瘓確診患者 (包括初次確診患者和已接受傳統(tǒng)療法治療無效者)分為丹參治療組 (對照組)15例，丹參配伍MSC治療組 (治療組)15例。

1.2.2 MSC體外培養(yǎng) 無菌條件局麻下骨穿抽取患者自體50ml新鮮骨髓液，PBS稀釋1倍后，輕輕疊加到50ml Ficol分離液上，在常溫下1500r/min，離心20min，分離出單核細胞，用加拿大Mesencult培養(yǎng)液重新懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為(1～5)×106/ml，接種于175cm2的細胞培養(yǎng)瓶中 (每瓶15ml)，放置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。3d后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁的懸浮細胞，10d后傳代，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化貼壁細胞，將細胞重新懸浮，按1∶2比例傳代。4d后半量換一次液，7d后0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收獲細胞。

1.2.3 MSC的鑒定 MSC的鑒定通過流式細胞儀檢測細胞表面CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表達，MSC 的特點是，并同時監(jiān)測細菌污染指標。

1.2.4 移植方案 采用靜脈滴注作為移植途徑，根據(jù)收獲的細胞數(shù)量確定移植次數(shù)，每次為 (1～5)×107個細胞。MSC治療組按1、3、5d 3次靜脈輸注MSC，輸注前30～60min靜脈滴注20%甘露醇250ml增強血腦脊液屏障的通透性。

1.2.5 臨床治療方案 對照組:丹參注射液10ml加入5%葡萄糖溶液250ml中，靜脈滴注，1次/d，連續(xù)14d。治療組在輸注MSC前1d開始連續(xù)使用丹參注射液14d。

1.3 療效評估

1.3.1 美國國立衛(wèi)生研究院卒中 (NIHSS)量表［3］采用NIHSS評定患者神經(jīng)功能缺損程度。臨床療效根據(jù)治療前后NIHSS評分的變化及殘障水平評定:(1)基本痊愈:NIHSS評分減少90%～100%，殘障水平0級;(2)顯著進步:NIHSS評分減少46% ～89%，殘障水平l～3級;(3)進步:NIHSS評分減少18%～45%;(4)無變化:NIHSS評分減少或增加＜18%;(5)惡化:NIHSS評分增加≥18%;(6)死亡。

1.3.2 比較功能綜合評定 (FCA)量表 每個項目滿分6分，最低分1分。本研究選取其中5個觀測內(nèi)容 (自我照料、括約肌控制、轉(zhuǎn)移、行走、上下樓梯)，即軀體功能評定，共分為13個項目觀測內(nèi)容，滿分78分，最低分13分。

1.3.3 主要觀察指標 以CT血管三維重建和彩色多普勒檢查，觀察動脈側(cè)支循環(huán)和腦梗死區(qū)域血流重建情況;檢查血、尿、便常規(guī)、肝、腎功能、心電圖等，全面了解患者病情。

1.4 安全性評估 觀察丹參注射液及MSC移植治療期間的不良反應。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗，兩兩比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NIHSS、FCA量表評分結(jié)果 兩組治療前與治療后14d和治療后28d NIHSS、FCA量表評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);對照組治療后14d和18d的NIHSS及FCA分別與治療組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 客觀評價標準 治療1個月后腦血管造影CT三維重建和彩色多普勒檢查示腦梗死區(qū)域有一定數(shù)量的新生側(cè)支血管。

2.3 不良反應 治療后患者無發(fā)熱反應及其他不適感，血、尿、便常規(guī)、肝、腎功能、心電圖等檢查未見特殊改變。

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

注:與同組治療前比較，*P＜0.05;與對照組比較，#P＜0.05

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3 討論

近年來關于MSC的生物學研究表明，MSC具有多向分化潛能，其攜帶了人體全部基因組，可同時對骨骼肌、心肌和神經(jīng)系統(tǒng)等受損組織進行修復［4］。MSC中的內(nèi)皮祖細胞為促血管新生細胞，能分化為血管內(nèi)皮細胞而誘導血管形成，使細胞移植治療缺血性疾病的研究取得了突破性的進展［5］。Kalka等［6］試驗證明，直接移植骨髓間充質(zhì)干細胞 (BMSCs)可增強一些缺血性疾病的血管生長，在缺血局部可橫向分化為血管內(nèi)皮細胞，并進一步分化形成新生毛細血管，形成新的側(cè)支，改善患者局部血供。而且Chen等［7］采用腦損傷組織勻漿進行體外MSC培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在含有腦損傷組織勻漿的培養(yǎng)環(huán)境下，MSC能產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植MSC促進神經(jīng)再生，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的生物學行為提供了分子生物學證據(jù)。

治療組在脫水、調(diào)控血壓、防止血小板聚集和改善腦供血等腦梗死肢體癱瘓常規(guī)治療基礎下，再用丹參注射液聯(lián)合MSC移植治療，結(jié)果顯示，兩組患者治療后14d和28d時的NIHSS和FCA評分均有改善，且治療組的評分均優(yōu)于對照組(P＜0.05)，這說明丹參注射液聯(lián)合MSC移植治療對改善腦梗死肢體癱瘓患者的神經(jīng)功能缺失，恢復患者的部分身體功能，使得患者恢復到患病前一定的日常生活能力。推測其機制可能包括:(1)丹參對于促進創(chuàng)傷修復再生、改善局部微循環(huán)、減輕組織缺血再灌注損傷等方面都具有較好作用。丹參多酚酸鹽是丹參水溶性活性部位，其能夠促進單核細胞合成和分泌VEGF、bFGF，進而促進內(nèi)皮細胞的遷移，推測丹參多酚酸鹽促進內(nèi)皮細胞遷移可能是促血管生成的機制之一［8］。 (2)MSC的神經(jīng)細胞分化潛能可產(chǎn)生某種程度的神經(jīng)再生，修復梗死腦組織［9］，而且MSC具有透過血腦脊液屏障和向病損部位遷移的能力［10］。(3)MSC在腦梗死區(qū)域可產(chǎn)生一系列BDNF和VEGF，起到神經(jīng)保護和血管再生的作用［7］。但具體的作用機制尚未明確，有待進一步的研究驗證。

培養(yǎng)得到的BMSCs靜脈輸注后，至今未觀察到嚴重不良反應，初步說明此技術(shù)方法是安全的。本組病例數(shù)少，觀察時間尚短，必須密切關注安全方面的問題，有待進一步進行大規(guī)模臨床試驗加以驗證。

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