王程強 (桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541001)

胡述立 (武漢亞洲心臟病醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

羅漢果葉總黃酮對金屬離子引起的內(nèi)皮細胞損傷保護作用及機制研究

王程強 (桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541001)

胡述立 (武漢亞洲心臟病醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

目的：研究羅漢果葉總黃酮對菲咯啉銅致人內(nèi)皮細胞ECV304 損傷的保護作用及機制，探討其在動脈粥樣硬化防治中的意義。方法：0.2mmol/ml菲咯啉銅誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞損傷，以1mg/ml羅漢果葉總黃酮干預(yù)24h，試劑盒測定細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量以及細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性。結(jié)果: 羅漢果葉總黃酮對菲咯啉銅誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)的損傷有明顯的抑制作用，血管內(nèi)皮細胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性增強。結(jié)論: 羅漢果葉總黃酮對菲咯啉銅導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，可能與其抗氧化效應(yīng)有關(guān)。

羅漢果葉總黃酮；ECV304；谷光甘肽過氧化物酶；超氧化物歧化酶

環(huán)境因素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，而血管內(nèi)皮細胞的受損往往是這一過程中的最早期事件[1]。但內(nèi)皮功能不全的確切機制還不十分清楚。越來越多的證據(jù)顯示菲咯啉銅能通過產(chǎn)生羥自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用而損傷內(nèi)皮細胞[2]。羅漢果作為廣西的特色資源，其葉在加工過程中一般被作為廢棄物丟棄，既浪費資源又污染環(huán)境。近年，陳全斌等采用磷鉬絡(luò)合物法測定了羅漢果葉黃酮的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)羅漢果葉黃酮具有一定的抗氧化活性，且對自由基具有很強的清除作用[3-4]。我們以體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞為研究對象，觀察人工提取的羅漢果葉總黃酮對菲咯啉銅誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制，為羅漢果葉總黃酮在治療動脈粥樣硬化中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

羅漢果葉：采于桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院植物園，50℃烘箱烘干，粉碎后備用。ECV304細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Hyclone公司，小牛血清購自Gibco公司。乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，D-300.3多功能電子天平，SHB-IIIA 真空泵，DJ靈巧型粉碎機。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ECV304細胞株用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液(含100mg/L青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)并置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)備用。

1.2.2 羅漢果葉總黃酮的制備與測定 參照梁英等[4]對羅漢果葉總黃酮的改良提取方法：固液比1∶30，煮沸提取3次，每次提取50min。以蘆丁為對照物，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色體系吸光光度法測定總黃酮的含量。

1.2.3 實驗分組 測定其它指標的細胞，無血清培養(yǎng)基同步化12h，隨機分為3組：①空白對照組(ECV304)：不加任何刺激因素；②菲咯啉銅組(ECV304+(Phen)2Cu2+)：加入終濃度為0.2mmol/ml的菲咯啉銅；③羅漢果葉總黃酮保護組(ECV304+(Phen)2Cu2++FLSG)：加入終濃度為0.2mmol/ml的菲咯啉銅和1mg/ml的羅漢果葉黃酮。各組細胞加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)液，測定LDH、MDA含量；收集細胞檢測SOD、GSH-PX活性。

1.2.4 測定LDH、MDA 含量以及SOD、GSH-PX活性 收集12 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書測定LDH和MDA含量；培養(yǎng)板中細胞用PBS洗2次，刮取細胞，加入冰冷PBS懸浮細胞，超聲15s，反復(fù)凍融3次，離心，按照試劑盒方法測定SOD、GSH-PX活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1羅漢果葉總黃酮的提取

按照改良方法提取的總黃酮得率為2.54%，與梁英等所做效率相近，用生理鹽水稀釋成所需濃度備用。

2.2羅漢果葉總黃酮對菲咯啉銅誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

細胞培養(yǎng)液中LDH檢測表明：經(jīng)(Phen)2Cu2+刺激24h后細胞分泌的LDH含量(419.27±16.73 )U/L，明顯高于未加任何處理因素的空白組(122.42±6.67 )U/L。而經(jīng)過終濃度為1mg/ml的羅漢果葉總黃酮處理的藥物保護組細胞分泌的LDH含量為(63.56±8.02 )U/L，明顯低于(Phen)2Cu2+組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)。FLSG組較(Phen)2Cu2+組MDA含量明顯降低，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，其中(Phen)2Cu2+組MDA為(1.298±0.091)μmol/L，而FLSG組MDA為(0.551±0.082)μmol/L；同時FLSG保護組的SOD、GSH-PX活性明顯高于(Phen)2Cu2+組，(Phen)2Cu2+組SOD為(21.95±2.47)mU/L，GSH-PX為(683.31±3.76)kU/L；FLSG保護組SOD為(32.17±2.56)mU/L，GSH-PX為1195.90±4.19)kU/L，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

3 討 論

環(huán)境因素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，而血管內(nèi)皮細胞的受損往往是這一過程中的最早期事件。菲咯啉銅能通過產(chǎn)生自由基·OH介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用而損傷內(nèi)皮細胞。羅漢果葉黃酮具有一定的抗氧化活性，且對自由基具有很強的清除作用。我們通過改良方法提取羅漢果葉總黃酮，提取效率很高。LDH 和MDA是一種細胞內(nèi)的酶，廣泛存在于細胞漿內(nèi)，當細胞破壞或細胞膜通透性增加時，其水平均明顯增高，可反映細胞或細胞膜損傷的程度[5-6]。菲咯啉銅作用于內(nèi)皮細胞24h后促進細胞膜脂質(zhì)過氧化和胞膜損傷，菲咯啉銅組LDH、MDA含量明顯升高，而羅漢果葉黃酮可使菲咯啉銅損傷細胞的LDH、MDA含量明顯降低，說明羅漢果葉黃酮通過清除氧自由基，達到修復(fù)受損的細胞膜和保護其完整性的作用。

高脂蛋白環(huán)境可使機體產(chǎn)生大量自由基，生物膜上的不飽和脂肪酸受活性氧作用，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，使生物膜結(jié)構(gòu)和功能改變，從而造成組織細胞的損傷。在保護細胞免受或減輕活性氧損傷的過程中，細胞內(nèi)SOD和GSH-PX等具有抗氧化功能的酶起著不可忽視的作用[7-8]。SOD催化超氧根陰離子生成H2O2和O2，GSH-PX可將H2O2和過氧化物還原為H2O或相應(yīng)無毒的醇。本結(jié)果證實,菲咯啉銅組細胞內(nèi)SOD和GSH活性較空白對照組降低，羅漢果葉黃酮保護組細胞內(nèi)SOD和GSH-PX活性比菲咯啉銅組顯著提高，可見羅漢果葉總黃酮具有保護細胞內(nèi)SOD和GSH-PX活性的作用，從而增強ECV304細胞自身抗氧化能力。綜上所述，羅漢果葉總黃酮可能是通過保護ECV304細胞內(nèi)SOD和GSH-PX活性從而保護內(nèi)皮細胞免于菲咯啉銅造成的損傷。羅漢果葉總黃酮作為抗氧化的中藥在動脈粥樣硬化的臨床治療上有著廣闊的前景。

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[編輯]一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.03.001

R589.2；R329.3

A

1673-1409(2012)03-R001-02

2012-01-03

2010年廣西自治區(qū)教育廳科研課題(201010lx358)

王程強(1981-)，男，湖北武漢人，講師，碩士，主要從事公共衛(wèi)生的教學(xué)與研究工作。