彭本英，陳建文，龔超龍，袁漢文 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

不同規(guī)格黃鱔補(bǔ)體溶血活性和T淋巴細(xì)胞數(shù)量的比較研究

彭本英，陳建文，龔超龍，袁漢文 (長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為了解不同規(guī)格黃鱔(Monopterusalbus)免疫能力的強(qiáng)弱，將其按體長(zhǎng)與體重分為3種規(guī)格，其中小規(guī)格組體長(zhǎng)(34.12±0.12)cm、體重(33.52±2.91)g,中等規(guī)格組體長(zhǎng)(38.75±1.89)cm、體重(60.57±18.89)g，大規(guī)格組體長(zhǎng)(54.02±1.84)cm、體重(158.74g±19.31)g。通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)溶血曲線，以兔紅細(xì)胞為指示細(xì)胞，測(cè)得小規(guī)格組血清中總補(bǔ)體溶血活性ACH50較小，為7.01U/ml；中規(guī)格組為8.29U/ml，大規(guī)格組為9.02U/ml。通過(guò)玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測(cè)了黃鱔血液中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，小規(guī)格組黃鱔血液形成的玫瑰花環(huán)百分率為28.7%，中規(guī)格組為31.3%，大規(guī)格組為33.7%。由此表明，隨著黃鱔規(guī)格的加大，血清中總補(bǔ)體溶血活性增強(qiáng)，T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，即黃鱔的免疫能力不斷提高。

黃鱔(Monopterusalbus)；補(bǔ)體溶血活性；T淋巴細(xì)胞；玫瑰花環(huán)；兔紅細(xì)胞

魚(yú)類也存在類似哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中均起著重要作用。魚(yú)類補(bǔ)體直接參與機(jī)體防御，其生物學(xué)活性影響機(jī)體抵抗微生物的能力、免疫反應(yīng)細(xì)胞間的通訊聯(lián)系、免疫復(fù)合物的形成和持續(xù)時(shí)間等[1]。魚(yú)類補(bǔ)體的調(diào)節(jié)作用能增強(qiáng)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫[2]。動(dòng)物T淋巴細(xì)胞表面具有結(jié)合異種動(dòng)物紅細(xì)胞的受體稱為E受體，在體外一定條件下，能與綿羊、兔等動(dòng)物的紅細(xì)胞結(jié)合，形成以T細(xì)胞為中心、紅細(xì)胞環(huán)繞在周?chē)?，宛似一朵玫瑰花樣的花環(huán)，故取名為E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)。凡能與紅細(xì)胞形成E花環(huán)的淋巴細(xì)胞稱E花環(huán)形成細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞是對(duì)綿羊紅細(xì)胞SRBC具有高度親和力的T細(xì)胞亞群，它與T細(xì)胞的體內(nèi)外功能活性密切相關(guān)，能更敏感地反映機(jī)體細(xì)胞免疫的水平和動(dòng)態(tài)變化，是目前檢測(cè)細(xì)胞免疫水平最為簡(jiǎn)便快速的方法之一[3-4]。

黃鱔(Monopterusalbus)是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值。其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，除食用價(jià)值外還有一定的藥用價(jià)值[5]。近年來(lái)，黃鱔的人工養(yǎng)殖獲得了迅速發(fā)展，但對(duì)黃鱔的免疫機(jī)制了解甚少，這嚴(yán)重制約了黃鱔養(yǎng)殖的免疫預(yù)防和病害防治。對(duì)黃鱔補(bǔ)體溶血活性和T淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行研究，不僅可豐富魚(yú)類免疫學(xué)研究?jī)?nèi)容，而且可以了解不同大小黃鱔免疫力的強(qiáng)弱，以利用生物技術(shù)進(jìn)行疾病防治，這對(duì)促進(jìn)黃鱔的健康無(wú)公害養(yǎng)殖具有積極意義。

表1 3種規(guī)格黃鱔的體長(zhǎng)與體重

1 材料與方法

1.1 材料

受試黃鱔購(gòu)于湖北省荊州市鐘鼓樓市場(chǎng)，大小不一，試驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)飼養(yǎng)7d，試驗(yàn)時(shí)按體長(zhǎng)與體重分為3種規(guī)格進(jìn)行試驗(yàn)。3種規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表1。

1.2 總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定

采用心臟取血法獲得兔紅細(xì)胞，并用等體積的阿氏液保存。在顯微鏡下計(jì)數(shù)兔紅細(xì)胞數(shù)量，并用EGTA-Mg-GVB沖洗3遍后，將血液稀釋至2×108/ml備用。采取3種規(guī)格的黃鱔血液，室溫靜置，收集血清。

由預(yù)備試驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)血清的適宜比例，正式試驗(yàn)時(shí)先將實(shí)驗(yàn)血清用EGTA-Mg-GVB準(zhǔn)確稀釋至適宜濃度，再在1～6#試驗(yàn)管中加入不同體積的EGTA-Mg2+-GVB，使每只離心管中最終溶液體積均為350μl，最后將200μl兔紅細(xì)胞加入每個(gè)離心管中；同時(shí)設(shè)置100%溶血管和0%溶血的空白對(duì)照管。具體如表2。

表2 試驗(yàn)管與對(duì)照管血清與兔紅細(xì)胞等的用量 μl

反應(yīng)體系在22℃水浴中維持90min，期間不時(shí)搖動(dòng)，然后冰浴2min終止反應(yīng)，且在1500r/min低溫離心5min，以0%溶血對(duì)照管作為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(D)。

將所測(cè)相應(yīng)樣品的光密度除以100%溶血對(duì)照管的光密度求得相應(yīng)樣品的溶血度(Z)。然后，以Z/(1-Z)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以血清用量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)溶血曲線。因50%溶血(Z=0.5)的Z/(1-Z)值等于1，故可由橫坐標(biāo)為1處在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距，此即產(chǎn)生50%溶血的待測(cè)血清的實(shí)際用量K，再由以下公式求得血清中總補(bǔ)體溶血活性ACH50。

1.3 玫瑰花環(huán)試驗(yàn)

分別抽取3種規(guī)格的黃鱔血液，按照文獻(xiàn)[6]的方法分離黃鱔淋巴細(xì)胞，將采集好的兔紅細(xì)胞和黃鱔白細(xì)胞按一定比例稀釋。取0.3ml胎牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔紅細(xì)胞和0.1ml黃鱔淋巴細(xì)胞，混勻；37℃水浴鍋中反應(yīng)25min后，500r/min離心5min；制備玫瑰花環(huán)制片，先后利用利用瑞氏液和吉姆薩氏液染色，洗片后在油鏡下進(jìn)行觀察。觀察時(shí)計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，凡吸附3個(gè)或更多家兔紅細(xì)胞的單核細(xì)胞為T(mén)淋巴細(xì)胞，并計(jì)算其所占的比例(%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同規(guī)格黃鱔血清中總補(bǔ)體溶血活性比較

圖1 3種規(guī)格黃鱔的總補(bǔ)體溶血活性

由圖1可以看出，小規(guī)格黃鱔的總補(bǔ)體溶血活性平均為7.01U/ml，中等規(guī)格黃鱔補(bǔ)體的溶血活性為8.29U/ml，大規(guī)格的黃鱔總補(bǔ)體的溶血活性平均為9.20U/ml?？梢?jiàn)，隨著黃鱔規(guī)格的增大，其血清中的補(bǔ)體溶血活性不斷增強(qiáng)。但是由標(biāo)準(zhǔn)差值可以看出，在小規(guī)格和中等規(guī)格階段黃鱔血清中總補(bǔ)體的溶血活性差異較大，而大規(guī)格黃鱔的變化差異就相對(duì)小的多。小規(guī)格黃鱔和中等規(guī)格黃鱔大多可以視為處于生長(zhǎng)期的黃鱔，而大規(guī)格黃鱔則完全已經(jīng)成熟，達(dá)到上市要求。由此可見(jiàn)，規(guī)格較大的黃鱔其血清中總補(bǔ)體的溶血活性就相對(duì)較高，其抗病能力就越強(qiáng)。

3.2 不同規(guī)格黃鱔的T淋巴細(xì)胞數(shù)量比較

圖2 3種規(guī)格黃鱔中T淋巴細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)的比例

由圖2可見(jiàn)，不同規(guī)格黃鱔形成玫瑰花環(huán)比例不同，大規(guī)格組黃鱔有33.7%的淋巴細(xì)胞能吸附3個(gè)以上的兔紅細(xì)胞，形成玫瑰花環(huán)，這樣的細(xì)胞為T(mén)淋巴細(xì)胞，而中規(guī)格組黃鱔有31.3%的淋巴細(xì)胞能形成玫瑰花環(huán)，小規(guī)格組黃鱔形成玫瑰花環(huán)的比例最低，僅28.7%。這說(shuō)明隨著黃鱔規(guī)格的不斷增加，黃鱔血清中能形成玫瑰花環(huán)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量也隨之增加。

3 討論

補(bǔ)體(Complement,C)是先天免疫防御中重要的體液功能分子，在被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗體的形成、介導(dǎo)病原體的清除[7]。自1894年P(guān)feiffer發(fā)現(xiàn)溶菌現(xiàn)象以來(lái)，對(duì)補(bǔ)體的研究己經(jīng)有100多年的歷史。魚(yú)類補(bǔ)體的研究起步比較晚，系統(tǒng)研究是20世紀(jì)80年代以后才開(kāi)始的[8]。研究表明，魚(yú)類補(bǔ)體可以通過(guò)激活旁路途徑高效溶解多種脊椎動(dòng)物如兔、綿羊、山羊、狗和人類血液中的紅細(xì)胞[6]，魚(yú)類補(bǔ)體具有較低的反應(yīng)溫度、較高的溶血活性以及成分的多態(tài)性[9]，其中魚(yú)類旁路途徑溶血活性比哺乳動(dòng)物的ACH50值高5～10倍，說(shuō)明旁路途徑在魚(yú)類先天性免疫中具有更重要的作用。但魚(yú)類補(bǔ)體可能對(duì)被溶解靶細(xì)胞的敏感性存在種類特異性差異[10]。通過(guò)旁路途徑魚(yú)類補(bǔ)體可以間接地裂解多種動(dòng)物紅細(xì)胞，魚(yú)類補(bǔ)體的這種性質(zhì)顯示魚(yú)類可能具有較寬范圍的識(shí)別外源物種的能力，這種識(shí)別非己成分的能力可能歸因于魚(yú)類的一些補(bǔ)體成分存在的多種亞型[11]。本研究將脊椎動(dòng)物血清補(bǔ)體溶血活性標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法應(yīng)用到黃鱔血清研究中，得出不同規(guī)格的黃鱔血清溶血活性的差異，證明在黃鱔中有補(bǔ)體的存在。在文昌魚(yú)體液中也出現(xiàn)補(bǔ)體樣的溶血活性，其補(bǔ)體C3濃度為1.17mg/ml，其含量與人及狗血清中的C3濃度基本相當(dāng)。此結(jié)果說(shuō)明，文昌魚(yú)體液中存在著類似于脊椎動(dòng)物替代途徑補(bǔ)體樣的溶血活性[12]。

淋巴細(xì)胞是魚(yú)類的主要免疫細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞是承擔(dān)細(xì)胞免疫的活性細(xì)胞，當(dāng)接受信息后，產(chǎn)生返祖、分裂，形成致敏淋巴細(xì)胞，可以發(fā)揮對(duì)靶細(xì)胞(微生物、腫瘤細(xì)胞等)的攻擊，同時(shí)將信息傳遞給B淋巴細(xì)胞，發(fā)揮協(xié)同作用[13]。魚(yú)類T淋巴細(xì)胞的分離與純化技術(shù)已經(jīng)很成熟。本研究結(jié)果表明，不同規(guī)格黃鱔T淋巴細(xì)胞數(shù)量并不一樣，揭示不同規(guī)格黃鱔免疫能力具有差異。

[1]張 靜,詹 勇,蘇 彬. 魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料,2008,(5):23-26.

[2]張 穎,劉洪柏,盧彤巖,等.魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(6):842-847.

[3]李春子,關(guān)曉清,周學(xué)章,等.應(yīng)用E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物T細(xì)胞[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2001,24(1):30-32.

[4]王秋嬋,胡庭俊,王延璞,等.用E-玫瑰花環(huán)法檢測(cè)117例健康牛羊豬外周血T淋巴細(xì)胞值[J].畜牧與獸醫(yī),1998,(3):14-16.

[5]舒妙安,馬有智,張建成.黃鱔肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,(4):15-19.

[6]Sunyer J O,Tort L.Natural hemolytic and bactericidal activities of sea breamSparusaurataserum are effected by the alternative complement pathway[J].Vet Immunol Immunopathol,1995,45:333-345.

[7]Gasque P,Jones J,Singhrao S K,et al.Identification of an astrocyte cell population from human brain that expresses perforin,a cytotoxic protein implicated in immune defense[J].J Exp Med,2004,187:451-460.

[8]Dodds A W，Day A J．The phylogeny and evolution of the complement system[J]．Immunol Med,l993,20:39-44.

[9]Magnadottir B.The spontaneous haemolytic activity of cod serum:heat insensitivity and other characteristics[J].Fish Shellfish Immunol,2000,10:731-735.

[10]Claire M H,Lambris J D.The complement system in teleosts [J].Fish Shellfish Immunol,2002,12:399-420.

[11]Sunyer J O,Tort L.Natural hemolytic and bactericidal activities of sea breamSparusaurataserum are effected by the alternative complement pathway[J].Vet Immunol Immunopathol,1995,45:333-345.

[12]王長(zhǎng)法.文昌魚(yú)體液和魚(yú)類血清補(bǔ)體溶血系統(tǒng)比較研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2003.

[13]陳全震,李亞南,邵健忠,等.魚(yú)類外周血淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),1999,6(4):26-30.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.09.007

S917

A

1673-1409(2012)09-S022-03

2012-08-10

彭本英(1968-)，女，湖北荊州人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)研究。