高艷軍，楊清玲，陳昌杰，丁勇興

(1.蚌埠醫(yī)學院臨床檢驗診斷學實驗中心;2.蚌埠醫(yī)學院生化與分子生物學教研室;3.蚌埠市中心醫(yī)院普外腫瘤科，安徽 蚌埠 233030)

腫瘤轉移是影響癌癥患者預后的重要因素之一，而轉移是由多個因素參與和多個步驟發(fā)展的過程。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在為腫瘤細胞提供遷移信號，促進其定向轉移并準確定位中可能扮演著至關重要的角色。CXCR4(chemokine receptor 4、CXCR4 和CD184)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，與其配體基質細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1、SDF-1α 和CXCL12)構成的生物學軸，可誘導腫瘤細胞趨化、轉移等諸多生物學效應。CXCR4 抑制性多肽(N-terminal 21-mer peptide，NT21MP)是趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ，vMIP-Ⅱ)N端部分氨基酸序列，可以選擇性結合CXCR4 受體，通過競爭性結合CXCR4 活性位點降低CXCL12/CXCR4 信號軸的作用，進而抑制乳腺癌細胞的趨化和轉移。雙分子熒光互補分析技術(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)是近年來出現(xiàn)的一種新技術，該技術可直觀地判斷目的蛋白在活細胞內的定位及相互作用。本研究通過構建NT21MP 和CXCR4 的BiFC 真核表達載體，求證二者在活細胞內是否可以相互結合從而啟動NT21MP 的生物學抑制效應。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞株SKBR3、非洲綠猴腎成纖維細胞株COS-7、大腸桿菌DH5α 菌及JM109 菌為本實驗室保存;pBiFC-VC155 載體、pBiFC-VN173 以 及 pBIFC-VN173-JUN 和pBIFC-VC155-FOS 陽性對照載體由美國普渡大學胡長燈教授惠贈;TRIzol 試劑購自Gibco 公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購自Sigma 公司;cDNA 合成試劑盒購自Fermentas 公司;CXCR4引物、NT21MP 均由上海捷瑞公司合成;TaKaRa Ex Taq? PCR 擴增試劑盒、限制性內切酶、PMDTM-18T 載體、T4 DNA 連接酶及膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司;質粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;退火緩沖液購自碧云天生物制劑公司。

1.2 方法

1.2.1 vMIPⅡN 端21 肽(NT21MP)目的基因的獲取 根據(jù)vMIP-ⅡN 端的氨基酸序列(Genbank:AAB62642)以及編碼vMIP-ⅡN 的開放閱讀框K4 基因(Genbank:U93872.2:21495 -21779)的核苷酸的序列確定了編碼vMIP-ⅡN 末端21個氨基酸肽的核苷酸序列作為目的基因。目的基因的兩端分別引入限制性內切核酸酶KpnⅠ和EcoRⅠ的靶位序列，將設計好的2 條核苷酸序列由捷瑞生物工程有限公司合成。其核苷酸序列:A:5'-AATTCAGAT GCTGGGAGCGTCCTGGCATAGACCGGACAAGT GCTGTCTCGGTTACCAGAAAAGACCATTACCAG GTAC-3';B:5'-CTGGTAATGGTCTTTTCTGGTA ACCGAGACAGCACTTGTCCGGTCTATGCCAGGA CGCTCCCAGCATCTG-3'。首先用消毒的雙蒸水溶解2 條單鏈核苷酸至100μmol/L;然后，在PCR 反應管中分別加入雙蒸水15μl、退火緩沖液5μl、寡核苷酸A 2.5μl 和寡核苷酸B 2.5μl，應用PCR 儀進行退火反應。PCR 反應條件:95℃變性2 min;每30 s 下降1℃，降至25℃;4℃保存。

1.2.2 pBiFC-VC155-NT21MP 的構建與鑒定將pBiFC-VC155 質粒載體用限制性核酸內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ在37℃雙酶切，電泳分離后純化回收。將已純化的酶切質粒與NT21MP的退火產物于16℃連接過夜，轉化至DH5α 感受態(tài)細胞。使用含氨芐西林(100 mg/L)的LB瓊脂平板篩選陽性克隆。抽提質粒，以KpnⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，酶切鑒定符合的克隆送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，測序結果與GenBank 中的數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.3 人類CXCR4 基因的PCR 擴增 根據(jù)Genbank 中收錄的CXCR4 的mRNA 序列(NM_003467.2)，設計PCR 上游引物:5'-GGAATT CAATGGAGGGGATCAGTATATACAC-3'，設 有EcoRⅠ酶切位點;下游引物:5'-GGGGTACCA AGCTGGAGTGAAAACTTGAAGACTCAGAC-3'，設有Kpn I 酶切位點。應用Trizol 法提取乳腺癌SKBR3 細胞株中總RNA，逆轉錄為cDNA 后以該cDNA 為模板應用上述引物進行PCR 擴增。PCR 反應條件:95℃預變性5 min，94℃變性45 s，66℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.4 人類CXCR4 基因的T 載體連接和鑒定PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，割膠回收目的片段，用試劑盒純化后與PMD18-T 載體連接(按試劑盒說明書進行)。CaCl法轉化至JM109 感受態(tài)細胞，篩選氨芐青霉素抗性克隆，抽提純化質粒，重組質粒PMD-18-T-CXCR4經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定后，委托生工生物工程(上海)有限公司進行測序驗證。

1.2.5 重組載體(pBiFC-VN173-CXCR4)的構建與鑒定 測序正確的CXCR4-T 載體和pBiFC-VN173 載體分別應用EcoRⅠ和KpnⅠ進行酶切。將酶切后的目的基因與載體經(jīng)過割膠回收純化后經(jīng)T4 DNA 連接酶于16℃連接過夜，并轉化感受態(tài)細胞DH5α 菌，使用含氨芐西林(100 mg/L)的LB 瓊脂平板篩選陽性克隆，抽提純化質粒，以KpnⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定，酶切鑒定符合的克隆委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.6 重組載體共轉染COS-7 細胞 將COS-7 細胞接種于24 孔板，每孔10個細胞，于500μl 無抗生素DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度達80%至90%且細胞生長狀態(tài)良好時進行轉染。轉染分組:①pBIFC-VN173 和pBIFCVC155 共轉染組;②pBIFC-VN173-CXCR4 轉染組;③pBIFC-VC155-NT21MP 轉染組;④pBIFCVN173-CXCR4 和pBIFC-VC155-NT21MP 共轉染組;⑤pBIFC-VN173-JUN 和pBIFC-VC155-FOS 共轉染組(陽性對照)。取2 支EP 管，分別標記為A 和B，各加入50μl 減血清培養(yǎng)液(OPTI-MEM)，A 管加入脂質體2μl，混勻后室溫靜置5 min，B 管加入質粒1μg(共轉染組每種0.5μg)，然后混勻A 和B 液，室溫靜置20 min，最后加入24 孔板中，37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 BiFC 重組質粒pBiFC-VC155-NT21MP 測序鑒定 將NT21MP 的DNA 與雙酶切后的pBiFC-VC155 質粒連接轉化，挑取陽性單克隆搖菌，取菌液送上海生工進行基因測序。測序結果顯示，在測序序列的343 至420 位堿基為目的插入片段，與目的DNA 比對完全正確(圖1)，其插入方向及閱讀框架正確，證明BiFC 重組質粒pBiFC-VC155-NT21MP 構建成功。

圖1 pBiFC-VC155-NT21MP 重組質粒部分測序圖Fig.1 Partial sequencing results of recombinant plasmid pBiFC-VC155-NT21MP

2.2 RT-PCR 對人類CXCR4 擴增 從乳腺癌SKBR細胞中提取總RNA，逆轉錄為cDNA 后應用上述CXCR4 引物擴增后行瓊脂糖凝膠電泳。在約1 074 bp處有一明顯條帶，與預期的CXCR4 基因片段相符(圖2)。

圖2 CXCR4 基因PCR 產物瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of CXCR4 gene PCR products

2.3 PMD18-T-CXCR4 載體和BiFC 重組載體pBiFC-VN173-CXCR4 構建與鑒定 CXCR4 的PCR 產物經(jīng)膠回收純化后與PMD18-T 載體連接轉化后，挑取單克隆搖菌，抽提質粒。應用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定重組質粒，切出約1 074 bp 和2.8 kb 大小的片段，同預期的長度和CXCR4 的PCR 結果均一致(圖3);同樣方法雙酶切鑒定重組質粒pBiFC-VN173-CXCR4，瓊脂糖電泳顯示約1 074 bp 和5.2 kb 的2 片段(圖4)。兩重組質粒測序結果與GenBank 中收錄的人CXCR4 的編碼序列除+621 bp(ATG為1)處單個堿基突變(但不影響氨基酸的編碼)外，其余完全相同(圖5)，且插入方向及閱讀框架正確，說明BiFC 重組真核表達載體pBiFC-VN173-CXCR4 構建成功。

圖3 PMD-18T-CXCR4 重組質粒限制性酶切鑒定Fig.3 The restriction enzyme digestion analysis of PMD-18T-CXCR4 recombi-nant vector

2.4 CXCR4 和NT21MP 相互結合的BiFC 分析 用不同的質粒單獨或共轉染COS-7 細胞24 h后熒光顯微鏡觀察BiFC 信號(綠色)。圖6 示，在pBIFC-VN173 和pBIFC-VC155 共轉染組、pBIFC-VN173-CXCR4 轉染組及 pBIFCVC155-NT21MP 轉染組中均檢測不到BiFC 信號的表達，而在pBIFC-VN173-CXCR4/pBIFCVC155-NT21MP 共轉染組B和C中，可以檢測到BiFC 信號，且綠色熒光主要定位于胞質內。同樣在陽性對照B和C中也可以觀察到熒光。

圖4 pBiFC-VN173-CXCR4 重組質粒限制性酶切Fig.4 The restriction enzyme digestion of pBiFC-VN173-CXCR4 recombinant vector

3 討論

趨化因子受體CXCR4(CD184)由Feng等于1996年發(fā)現(xiàn)的，其是一種結構高度保守的7次跨膜受體，是G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員?；|細胞來源因子1α(stromal cellderived factor 1，SDF-1α)又名CXCL12，其唯一受體為CXCR4。研究表明CXCL12/CXCR4生物學軸對腫瘤的影響是多方面的，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中發(fā)揮重要作用［2，8-12］。

vMIP-ⅡN 端21 肽(NT21MP)是本室根據(jù)vMIP-ⅡN 端與CXCR4 結合的高度保守區(qū)，通過固相合成技術制備的活性多肽，能夠與CXCR4 特異性結合，在活性測定和動物實驗中均表現(xiàn)出高效的CXCR4 抑制活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，NT21MP 能夠抑制乳腺癌細胞的趨化及增殖，并誘導乳腺癌細胞的凋亡，其可能作用機制是NT21MP 通過與CXCL12 競爭結合于CXCR4，進而抑制了CXCL12/CXCR4 的AKT、ERK等多種胞內信號途徑的激活。但這些實驗研究都是建立在體外實驗和通過動物實驗間接測定的基礎之上，目前還沒有在活細胞內直接觀察NT21MP 與CXCR4 相互作用的實驗報道。

圖5 pBiFC-VN173-CXCR4 重組質粒部分測序圖Fig.5 Partial sequencing results of recombinant plasmid pBiFC-VC155-NT21MP

圖6 NT21MP 和CXCR4 在COS-7 細胞中的雙分子熒光互補分析圖Fig.6 BiFC analysis of NT21MP and CXCR4 in recombinant plasmid-transfected COS-7 cells

BiFC 技術是近年來由胡長燈教授首創(chuàng)的一種直觀、快速地判斷目的蛋白在細胞中定位和相互作用的新技術。Geoffrey 等研究發(fā)現(xiàn)，在GFP 的2個β 片層之間的環(huán)結構上至少有10個位點可以插入外源蛋白而不影響GFP 的熒光活性。BiFC 技術正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，在環(huán)結構的特異位點將熒光蛋白切成N 端片段和C 端片段兩部分后，再由一小段氨基酸序列l(wèi)inker 分別與目標蛋白連接。將重組好的基因構建入載體，共轉染細胞，兩段重組基因在細胞中融合表達。若目標蛋白間存在相互作用，通過linker 牽引熒光蛋白的N 端片段與C 端片段就能夠相互靠近，形成熒光蛋白生色團重新發(fā)出熒光。該技術的關鍵是將擬觀察的目的蛋白的基因定向插入至相應的真核表達載體。將構建好的質粒共轉染細胞后，在熒光顯微鏡下檢測是否有互補熒光產生，就可以推斷出兩目標蛋白是否發(fā)生了相互作用。

本實驗成功構建了vMIP-ⅡN 端21 肽(NT21MP)和CXCR4 基因的BIFC 真核表達載體。在構建的質粒中，NT21MP 和CXCR4 編碼序列分別與Venus C 端155-238 位氨基酸殘基和N 端1-172 位氨基酸殘基的編碼序列片段連接。共轉染二者的重組質粒，若NT21MP 和CXCR4 可以結合，二者在胞內相互作用即可以使熒光蛋白重新恢復熒光活性。本實驗應用空BiFC 載體以及重組載體單獨和共轉染至COS-7 細胞，轉染24h 后通過熒光顯微鏡觀察，在空載體共轉染以及重組質粒單獨轉染組中無BiFC 信 號，在 pBIFC-VN173-CXCR4/pBIFCVC155-NT21MP 共轉染組以及陽性對照組中則檢測到綠色熒光信號(圖6)。利用BiFC 技術觀察到二者在活細胞中的相互作用，這充分說明二者在胞內可以相互結合;同時，為我們前期研究NT21MP 通過競爭性的結合受體CXCR4上的活性位點，CXCL12/CXCR4 生物軸的胞內信號無法進行有效激活，而進一步抑制乳腺癌細胞株的趨化、增殖以及促進凋亡的作用機制提供了一個有力的佐證。

腫瘤分子靶向治療是一種研究發(fā)現(xiàn)的新興腫瘤治療方法之一。CXCR4 參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，為多種疾病的重要治療靶點，如艾滋病、腫瘤和風濕性關節(jié)炎等，尤其在腫瘤轉移方面。NT21MP 作為化學合成肽能夠直接作用于CXCR4 靶點，在本實驗中得到了充分的證明，為NT21MP 向生物活性制劑靶向治療腫瘤轉移的研究方向的設想提供了理論支持。傳統(tǒng)的研究方法存在一定的缺陷:如免疫熒光的透化過程會對細胞造成損傷，而免疫共沉淀技術要求必須破碎細胞。它們都無法做到在活細胞生理條件下實時、直接、快速地對細胞內NT21MP 與CXCR4 間相互作用進行動態(tài)研究。BiFC 技術能彌補這一缺陷，并在研究轉錄因子間的相互作用及其亞細胞定位，尋找G 蛋白可能存在相互作用的β 和γ 亞基，利用多色熒光互補技術同時檢測多種蛋白質間的相互作用以及檢測泛素化途徑等相關生命科學領域中均得到具體應用。

總之，本實驗成功構建了應用于BiFC 技術的真核表達載體，并且在活細胞內檢測到NT21MP 與CXCR4 的互相結合，為進一步研究NT21MP 通過CXCL12/CXCR4 軸發(fā)揮的受體拮抗作用奠定了良好的基礎。

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