劉慶鑫，李慧梁，柳潤輝

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)系，福建 福州 350108, 2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海 200433)

·綜述·

微生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

劉慶鑫1，李慧梁2，柳潤輝2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)系，福建 福州 350108, 2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海 200433)

隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化逐漸應(yīng)用于天然產(chǎn)物的研究中。本文簡介了微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的專一有效、反應(yīng)條件溫和、收率高等特點，對近5年來微生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用進行了綜述，重點綜述了微生物對蒽醌類、黃酮類、萜類、甾體類、生物堿類和苷類化合物的生物轉(zhuǎn)化，并對其發(fā)展前景進行了展望。

微生物轉(zhuǎn)化；天然產(chǎn)物研究；應(yīng)用

1 概述

微生物轉(zhuǎn)化是指某一微生物將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)(產(chǎn)物)的過程，這一過程是由此種微生物產(chǎn)生的一種或者幾種特殊的胞內(nèi)或胞外酶作為生物催化劑來進行的一種或者幾種化學(xué)反應(yīng)，簡而言之，即為一種利用微生物酶或者微生物本身來進行的合成技術(shù)。這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對微生物的生命過程也是必需的，但是在微生物轉(zhuǎn)化的過程中，這些酶僅作為生物催化劑作用于化學(xué)反應(yīng)。由于微生物所產(chǎn)生的大多數(shù)生物催化劑不僅可以催化自身的底物和其類似物，且有時還對外源添加的底物也具有催化作用，因而微生物轉(zhuǎn)化也可以認為是有機化學(xué)反應(yīng)中的一個特殊分支[1]。與酶轉(zhuǎn)化和懸浮細胞轉(zhuǎn)化相比，微生物轉(zhuǎn)化操作更簡易，有利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

2 微生物轉(zhuǎn)化的特點

2.1反應(yīng)專一有效 微生物轉(zhuǎn)化不需要添加其它的催化劑，只需先培養(yǎng)出大量的微生物菌種，然后加入底物進行單一的催化反應(yīng)。此催化反應(yīng)可以多次重復(fù)。它可以完成某些有機合成難以實現(xiàn)或者不可能實現(xiàn)的反應(yīng)，所以微生物轉(zhuǎn)化法比化學(xué)試劑的反應(yīng)法更專一、更有效。

2.2反應(yīng)條件溫和 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)一般都是在常溫和pH為7左右的條件下進行催化反應(yīng)，不需要高溫、高壓等苛刻的條件。設(shè)備的運行操作也比較簡單、安全，產(chǎn)生的公害較少，一般不會造成環(huán)境污染，后處理也相對簡單。

2.3篩選不同的菌種與優(yōu)化反應(yīng)條件可提高轉(zhuǎn)化率 對同一底物進行微生物轉(zhuǎn)化的菌種可能有多種，通過篩選選出最佳菌種，可以保證較高的轉(zhuǎn)化率。微生物轉(zhuǎn)化底物的過程中易受到底物濃度、溫度和反應(yīng)時間等影響。郭繼強等[2]利用正交實驗設(shè)計法，對喜樹堿的生物轉(zhuǎn)化菌種及反應(yīng)條件進行優(yōu)化研究，最終發(fā)現(xiàn)假單胞菌Blx在轉(zhuǎn)化時間60 h、溫度28 ℃、濃度為0.1 g/L、pH為6.5時，菌種具有最高轉(zhuǎn)化率19.1%。

3 微生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用

上個世紀50年代,美國Upjohn公司的Murray和Peterson成功地使用黑根霉(Rhizopusnigricans)一步在孕酮11位上導(dǎo)入一個α羥基，使用孕酮合成皮質(zhì)酮僅需3步，且收率高達90%，可的松從而問世，使體內(nèi)各類微量的甾體激素成為臨床治療藥物，是工業(yè)化生物轉(zhuǎn)化的重要里程碑[3]，如圖1。他們還利用紫羅蘭梨頭霉(Tieghemellaorchidis)在氫化可的松前體RSA (17α-羥基孕甾-4-烯-3, 20-二酮-21-醋酸酯)中導(dǎo)入11β-羥基。這些特異性的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)為其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖1 孕酮的微生物轉(zhuǎn)化

微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件溫和、高選擇性等特點已經(jīng)倍受天然產(chǎn)物學(xué)家的關(guān)注。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的可由微生物轉(zhuǎn)化作用完成的反應(yīng)有氧化、還原、水解、裂解、降解等多種反應(yīng)[4]，在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用也十分廣泛。在醌類、黃酮類、萜類、甾體類、生物堿類和苷類化合物都有很深入的研究。

3.1醌類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 張薇等[5]利用刺囊毛霉對大黃中的大黃酚、大黃素和大黃素甲醚進行微生物轉(zhuǎn)化，共得到4個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如圖2，主要以糖苷化和甲基化反應(yīng)為主。在大黃藥材中結(jié)合型蒽醌衍生物主導(dǎo)瀉下作用。大黃經(jīng)酒精酵母、面包酵母轉(zhuǎn)化后，總蒽醌和結(jié)合型蒽醌的含量略有降低，游離型蒽醌含量增加約6倍，緩和了大黃的瀉下作用和對胃腸道的刺激，可見微生物轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于大黃藥材的炮制中[6]。

圖2 大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的微生物轉(zhuǎn)化

3.2黃酮類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 槲皮素是典型的黃酮類化合物，具有較好的祛痰、止咳、平喘等作用。近幾年的研究表明，槲皮素是已知的最強抗癌劑之一 ，在治療腫瘤疾病上的需求量很大，因此開發(fā)槲皮素具有良好的市場前景[7]。利用灰色鏈霉菌對蘆丁進行微生物轉(zhuǎn)化，分離鑒定了6個代謝產(chǎn)物，除了槲皮素還有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-β-D-蕓香糖苷、異鼠李素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚，此轉(zhuǎn)化過程涉及到糖苷水解、甲基化和去羥基化反應(yīng)，共3類反應(yīng)。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用黑曲霉可將槐米中的蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素，如圖3，且轉(zhuǎn)化所得的槲皮素純度較高[8～10]，具有轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用價值。

圖3 蘆丁的微生物轉(zhuǎn)化

此外，楊莉萍等[11]發(fā)現(xiàn)采用融粘帚霉AS3.3987對葛根素進行微生物轉(zhuǎn)化，生成的主要產(chǎn)物是3-羥基葛根素，其得率最高為93.2 mg/g葛根素。汪紅等[12]篩選到一株菌株HQ-10，可以將黃芩作為底物，通過產(chǎn)生葡萄糖醛酸酶發(fā)酵將黃芩中的黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素，且黃芩苷轉(zhuǎn)化率近于92%。

3.3萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 微生物轉(zhuǎn)化在萜類化合物的相關(guān)研究中應(yīng)用的比較多，如青蒿素。青蒿素是我國科學(xué)研究者首次從黃花蒿葉中提取分離得到的一個具有過氧橋的倍半萜類化合物，具有高效低毒的抗瘧活性，尤其是對具有抗氯喹能力的腦瘧和急性瘧有效。陳有根和余伯陽利用微生物Streptomycesgriseus(ATCC-13273)對青蒿素進行轉(zhuǎn)化，得到一個新化合物9α-羥基青蒿素，體外抗瘧實驗表明該化合物具有抗惡性瘧原蟲FCC/HN的活性[13]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，華根霉、雅致小克銀漢霉、刺孢小克銀漢霉、黑曲霉和毛霉對青蒿素也有不同的轉(zhuǎn)化[14,15]。

此外，還有許多其他萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究。如可利用新月彎孢霉KA-9或者刺囊毛霉AS3.345對甘草次酸進行微生物轉(zhuǎn)化，獲得化合物7β-羥基甘草次酸，如圖4[16～18]；占紀勛等[19]利用銅綠假單孢菌AS1.860對紫杉醇進行微生物轉(zhuǎn)化，獲得3個化合物，如圖5；李合平等[20]從土壤中分離得到的變形斑沙雷菌對穿心蓮內(nèi)酯有較好的轉(zhuǎn)化活性，如圖6，轉(zhuǎn)化率約70%；雅致小克銀漢霉除了對青蒿素有轉(zhuǎn)化活性，對黃柏酮同樣有良好的轉(zhuǎn)化活性[21]。

圖4 甘草次酸的微生物轉(zhuǎn)化

圖5 銅綠假單孢菌AS1.860對紫杉醇的微生物轉(zhuǎn)化

圖6 穿心蓮內(nèi)酯的微生物轉(zhuǎn)化

3.4甾體類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 李于善和賀艷[22]將從三峽白首烏中分離得到的C21甾苷元告達庭甾苷元和開德甾苷元作為底物，利用黑根霉與赭曲霉在水-正丁醇的雙相體系中，轉(zhuǎn)化得到C11α-羥基化的C21甾苷元告達庭苷元和開德苷元，轉(zhuǎn)化率達74.1%如圖7。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，利用菌株MycobacteriumHCCB006能夠?qū)㈢薮碱惢衔镛D(zhuǎn)化為雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)[23,24]，而ADD則是合成甾體藥物的重要前體化合物。這一研究的發(fā)現(xiàn)為天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為重要的前體化合物提供了理論依據(jù)。

圖7 告達庭甾苷元的微生物轉(zhuǎn)化

3.5生物堿類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 喜樹堿和10-羥基喜樹堿是從喜樹中分離的天然抗腫瘤活性成分。10-羥基喜樹堿比喜樹堿的抗腫瘤效果更好、毒性更低，因此在全球市場上成為繼紫杉醇之后第2個獲準上市的具有抗癌活性的天然產(chǎn)物，并日益成為喜樹堿類衍生物研究的重要中間體。但由于10-羥基喜樹堿在喜樹的種子內(nèi)含量極低，科研人員一直在尋求有效的方法對喜樹堿進行結(jié)構(gòu)上的修飾和改造，以獲得活性更好的10-羥基喜樹堿。近期的研究發(fā)現(xiàn) ，采用假單胞菌Bl、毛霉和禾谷鐮刀菌均可以將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿，如圖8，為喜樹堿的衍生物合成開辟了新的途徑[2,25]。

圖8 喜樹堿的微生物轉(zhuǎn)化

本教研室近幾年也著眼于甾體生物堿的微生物轉(zhuǎn)化，藜蘆生物堿具有良好的抗腫瘤活性，因而越來越受到世人的關(guān)注。通過刺孢小克銀漢霉對vermitaline進行生物轉(zhuǎn)化，共獲得4個新化合物，如圖9[26]。

3.6苷類化合物的微生物轉(zhuǎn)化 大多數(shù)的天然產(chǎn)物均可與糖或者糖的衍生物形成苷，酸堿水解可打斷糖苷鍵生成苷元但不適用于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的苷類化合物。而微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，適于對苷類化合物的水解。由于人參皂苷具有良好的藥理活性而備受關(guān)注，對它的微生物轉(zhuǎn)化研究也相對較多。以人參皂苷Rb1為例，經(jīng)青霉屬菌株GH-9轉(zhuǎn)化可生成人參皂苷C-K，此產(chǎn)物具有抑制癌細胞生長以及抗癌細胞轉(zhuǎn)移的作用，是一種具有良好開發(fā)前景的抗癌藥物成分；經(jīng)GY-06轉(zhuǎn)化可以生成Rd和Rg3；從中國廣東產(chǎn)的橙子中分離到的菌株CZ2對人參皂苷Rb1具有較好的生物轉(zhuǎn)化活性，可將其轉(zhuǎn)化為稀有的次級人參皂苷F2，人參皂苷F2對肺癌SPC-A-l以及胃癌SGC-7901細胞均具有一定的抑制作用，如圖10和表1[27～29]。除了對人參皂苷的研究外，還有很多其他苷類化合物的研究。田天麗等[30]從中藥虎杖中篩選出根霉菌株T-34，利用該菌株能將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，且轉(zhuǎn)化率高達98%，而白藜蘆醇具有良好的抗心血管疾病和抗癌的功效。研究發(fā)現(xiàn)青霉Penicilliumnigricans可將京尼平苷轉(zhuǎn)化為具有抗肝硬化、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化等活性的京尼平，且轉(zhuǎn)化率高達95%以上[31]。

圖9 vermitaline的微生物轉(zhuǎn)化

圖10 人參皂苷Rb1、C-K、Rd、Rg3和F2的結(jié)構(gòu)

人參皂苷R1R2Rb1-Glc2-1Glc-Glc6-1GlcC-K-H-GlcRd-Glc2-1Glc-GlcRg3-Glc2-1Glc-HF2-Glc-Glc

這些天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的機制都已經(jīng)基本上進行過深入研究，其中許多相關(guān)的酶己經(jīng)被分離純化，國外已經(jīng)開始把微生物轉(zhuǎn)化或其中的酶作為高效催化工具來使用，并且對此進行了廣泛而深入的科學(xué)研究。

4 微生物轉(zhuǎn)化研究的未來展望

微生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用不僅僅局限于以上幾個方面，在現(xiàn)代社會其工業(yè)化的發(fā)展具有極大的潛力。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)以及基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，利用誘變篩選新菌種或者改建基因生成新的工程菌,可以使微生物轉(zhuǎn)化在醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用中目的更加明確、方法更加簡單。我國天然產(chǎn)物資源豐富，擁有良好的研究基礎(chǔ)。且天然產(chǎn)物大多為分子結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜的有機化合物，將微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)引入到天然產(chǎn)物的研究中，包括資源開發(fā)、藥物設(shè)計和新的活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與篩選等各個環(huán)節(jié)，從而開發(fā)出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)、并具有中國特色的創(chuàng)新藥物。

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Applicationofmicrobialtransformationinnaturalproductsresearch

LIU Qing-xin1, LI Hui-liang2, LIU Run-hui2

(1. Department of Pharmacy, Fujian Traditional Chinese Medicine University, Fuzhou 350108，China;2 .Department of Phytochemistry,School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)

With the continuous development of biotechnology technology, microbial transformation gradually was applied to the study of natural products. The specific effective reactions, mild reaction conditions and high yield of the microbial transformation were outlined in this paper. The applications were reviewed in the microbial transformation of natural products in recent five years, especially in anthraquinones, flavonoids, terpenoids, steroids, alkaloids and glycosides. The developments of microbial transformation were prospected.

microbial transformation; natural products research; applications

劉慶鑫(1988-)，男，碩士研究生.Tel：(021)81871252，E-mail:lqx.007@163.com.cn.

柳潤輝.Tel:(021)81871245，E-mail:lyliurh@126.com.

Q93；R93

A

1006-0111(2012)05-0321-05

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.05.001

2012-02-02

[修回日期]2012-03-26