朱孝中,劉德森,俞力超,胡嘉波,王曉慧

(1.江蘇大學附屬醫(yī)院胸外科,江蘇鎮(zhèn)江,212001;2.江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,江蘇鎮(zhèn)江,212013)

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是來源于中胚層的一類多能干細胞,主要存在于結締組織和器官間質(zhì)中。近來研究[1-2]顯示間充質(zhì)干細胞可被腫瘤細胞釋放的生長因子、細胞因子等生物信號募集至腫瘤組織,與腫瘤組織相互作用,分化形成微環(huán)境中各種基質(zhì)細胞,參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移行為。本研究擬從食管癌及癌旁組織中分離和純化出食管癌間充質(zhì)干細胞,并將其與食管癌細胞株Eca-109共培養(yǎng),探討間充質(zhì)干細胞對食管癌細胞株侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清(FBS)、低糖細胞培養(yǎng)基(DMEM)、Trizol試劑(Invitrogen公司),Ⅳ型膠原酶(Sigma公司),青霉素和鏈霉素(華北制藥公司),氟康唑(江蘇濟川制藥公司),RT-PCR成套試劑盒(MMLV反轉(zhuǎn)錄酶)(Toyobo公司),鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、鈣黏蛋白(E-cadherin)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和羊抗鼠免疫球蛋白-G(IgG)(Cell Signal公司),Eca-109(中科院細胞所),引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 食管癌組織和癌旁組織間質(zhì)干細胞的分離純化

新鮮的食管癌組織和癌旁組織塊用含青霉素、鏈霉素及氟康唑的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌浸泡約15 min,洗凈殘留血液,將組織塊剪碎為大約1 mm的組織塊并用0.1%Ⅳ膠原酶消化后培養(yǎng)于含20%胎牛血清的L-DMEM中,并種于35 mm培養(yǎng)皿中,37℃,5%CO2,飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待接近融合時用0.25%胰酶室溫消化,細胞按1∶3比例傳代,若干次傳代,即得到純化的間質(zhì)干細胞。

1.3 間質(zhì)干細胞與食管癌細胞株ECA-109非接觸共培養(yǎng)

采用六孔板的 Transwell(孔直徑為 0.4 μ m,Costar公司)構建共培養(yǎng)體系。分3組:單純食管癌細胞株Eca-109組、單純間充質(zhì)干細胞組、食管癌細胞株 Eca-109位于 Transwell孔的下部,MSCs的膜上。上述細胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的L-DMEM中,72 h后終止培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR

按TRIzol試劑盒說明提取上述3組細胞總RNA,使用紫外分光光度計測定RNA濃度。根據(jù)RNA純度將每組的RNA調(diào)至每個反應體系中含1 μg?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)引物上游序列為 5′-CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3′;下游序列為 5′-GCCACTTGTCGGCGATAAGG-3′;擴增產(chǎn)物為 263 bp。抑癌基因E-cadherin引物上游序列為5′-TGGGCTGGACCGAGAGAGT T;下游序列為3′-ATCTCCAGCCAGTTGGCAG;擴增產(chǎn)物為592 bp。內(nèi)參GAPDH引物上游序列為5′-CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′;下游序列為 5′-TGTTCTCATACTTCTCAT-3′;擴增產(chǎn)物為 203 bp。對RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,數(shù)字成像系統(tǒng)進行拍照分析。

1.5 Western blot檢測

用預冷的PBS洗滌細胞3遍,收集細胞,用細胞裂解液裂解細胞,提取細胞總蛋白,考馬斯藍法定量,95℃煮沸5 min。取40 μg蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳,后將蛋白通過電轉(zhuǎn)膜的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,5 g/L脫脂奶粉封閉后,分別與抗MMP-9和E-cadherin單克隆抗體雜交,再與相應的酶標記二抗反應,陽性條帶用化學發(fā)光法檢測,放置Kodak活體成像儀直接數(shù)碼顯色。

2 結 果

2.1 hEC-MSCs形態(tài)學特征

膠原酶消化法原代培養(yǎng)14 d后,一般可見少量長梭形貼壁細胞(圖1A),培養(yǎng)30 d后,細胞基本可鋪滿皿底(圖1B),傳至第3代時能得到比較純凈的間充質(zhì)干樣細胞(圖1C)。

圖1 少量長梭形貼壁細胞

2.2 RT-PCR

3組細胞均成功地擴增出目的片段,其中間充質(zhì)干細胞與食管癌細胞株共培養(yǎng)組MMP-9 mRNA表達量明顯高于食管癌細胞株,而E-cadherin mRNA表達量明顯低于食管癌細胞株(圖2)。

2.3 Western-blotting

Western-blotting結果顯示間充質(zhì)干細胞可明顯上調(diào)食管癌細胞株中的MMP-9表達,顯著下調(diào)E-cadherin的表達(圖3)。

圖2 3組細胞RT-PCR

圖3 Western-blotting結果

3 討 論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響食管癌患者生活質(zhì)量及預后的重要因素。E-cadherin是一種重要的細胞黏附分子,是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型中的一種,在維持正常上皮細胞形態(tài),細胞極性及組織結構完整性中發(fā)揮重要作用,是目前公認的抑癌基因之一[3]。E-cadherin結構和功能異常可導致腫瘤細胞間的黏附能力減弱,使腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶而侵入周圍組織和血管,進而擴散和轉(zhuǎn)移。研究[4]顯示:E-cadherin的低表達與食管癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關,并在食管癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。本實驗結果顯示食管間充質(zhì)干細胞可下調(diào)食管癌細胞株Eca-109中的E-cadherin的表達,表明食管間充質(zhì)干細胞可參與調(diào)節(jié)食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

在腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中,除與細胞間黏附能力參與其中外,細胞外基質(zhì)降解亦是其重要步驟之一?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是細胞外基質(zhì)降解過程中一個重要因子,其屬于明膠酶類,作用底物廣泛,表達細胞眾多。MMP-9可通過降解細胞外基質(zhì)中的大分子,如膠原和蛋白糖胺等引起組織改型,促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。國外研究[5]顯示食管癌組織中MMP-9表達水平明顯高于正常組織,并在食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)研究[6]亦報道MMP-9在食管癌組織中的表達隨著腫瘤的浸潤深度的增加,陽性表達率增加。本研究結果顯示食管間充質(zhì)干細胞可上調(diào)食管癌細胞株Eca-109中的MMP-9的表達,這亦表明食管間充質(zhì)干細胞可參與調(diào)節(jié)食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

目前關于MSCs對腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響還存在著爭議。本研究通過將食管間充質(zhì)干細胞與食管癌細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞通過影響細胞黏附分子和細胞基質(zhì)降解酶的表達,參與調(diào)節(jié)食管癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

[1]Halpern J L,KilbargerA,Lynch CC.Mesenchymal stem cells promote mammary cancer cell migration in vitro via the CXCR2 receptor[J].Cancer Lett,2011,308(1):91.

[2]Bagley R G,Weber W,Rouleau C,et al.Human mesenchymal stem cells from bone marrow express tumor endothelial and stromal markers[J].Int J Oncol,2009,34(3):619.

[3]Ray M E,Mehra R,Sandier H M,et al.E-cadherin protein expression predicts prostate can cer salvage radiotherapy outcomes[J].J Urol,2006,176(4 Pt 1):1409.

[4]Cheng C W,Wu P E,Yu J C,et al.Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast carcinoma:Modification of the twohit hypothesis of tumor suppressor gene[J].Oncogene,2001,20(29):3814.

[5]Tanoka Y,Yoshida T,Yagawa T,et al.Matrix metallo-proteinase-7 and matrix metallo-proteinase-9 are associated with unfavourable prognosis in superficial esophageal cancer[J].Br Cancer,2003,89(11):2116.

[6]王永霞,李道明,李海梅,等.NF-κB p65和MM P-9蛋白在食管鱗癌中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學,2011,32(18):2401.