曲 良

（中海石油環(huán)保服務（天津）有限公司 天津 300457）

生物標志物在海洋溢油污染評價中的應用＊

曲 良

（中海石油環(huán)保服務（天津）有限公司 天津 300457）

生物標志物是指能夠描述或表征生物機體所產生的各種變化的標志物或指標，在海洋污染評價領域具有較好的應用前景。文章詳細綜述了國內外應用于海洋溢油污染評價的生物標志物類型、特點和研究現(xiàn)狀。同時結合海洋開發(fā)與管理，提出了目前研究的不足之處，指出了今后開展相關研究的方向，包括針對海洋溢油污染特點篩選特異性強、穩(wěn)定性好的生物標志物以及基于生物標志物的海上平臺石油污染預警系統(tǒng)的建立等。

生物標志物；海洋溢油污染；評價；應用

海洋溢油是指由人類活動所引起的原油向海洋的泄漏。隨著海上原油開采和原油遠洋運輸?shù)葮I(yè)務的日益增加，海洋溢油事故頻繁發(fā)生。在近20年由于船舶事故所引發(fā)的溢油污染中，溢油量在7 t以上的事故約1 780起，其中700 t以上的重大溢油事故458起［1］。隨著有史以來美國海域最嚴重的溢油事故——“深水地平線”平臺溢油事故的發(fā)生，海洋溢油污染已經成為現(xiàn)階段海洋開發(fā)與管理領域所關注的重點。

溢油污染嚴重影響到海洋的生態(tài)安全。對于較低營養(yǎng)級的細菌，溢油污染可能會改變浮游細菌的營養(yǎng)源（如，碳源），并進一步影響其群落結構的組成［2］。對于浮游植物，溢油在海上形成的油膜會影響其光合作用過程，從而影響其生長［3］；一些研究也表明石油烴也可能促進浮游植物的生長，進而一定程度上促進赤潮的發(fā)生［4］。對于高營養(yǎng)級的浮游動物，溢油污染物中的毒性物質通過吸收和攝食等途徑進入生物體內后，會影響其代謝過程、造成神經以及生殖系統(tǒng)的損傷，如多環(huán)芳香烴類物質能夠與DNA分子堿基共價結合，形成DNA加合物，成為致突變或致癌因子［5］。因此，準確、快速檢測溢油濃度和分析溢油污染程度，不僅是客觀評估溢油污染損害的基礎，而且是及時響應和確定應急處置措施以降低溢油污染對海洋生態(tài)環(huán)境破壞的關鍵，因而是目前溢油污染防治領域研究中的重點。目前，溢油污染主要通過化學方法檢測，主要包括：重量法、環(huán)己烷萃取熒光分光光度法、氟利昂－環(huán)己烷體系熒光分光光度法、紫外分光光度法、紅外法和填充柱氣相色譜法等。但是，這些化學方法僅能檢測石油烴的濃度，而無法評價溢油污染物對海洋生態(tài)系統(tǒng)的損害程度以及生態(tài)系統(tǒng)對溢油污染物的響應變化。生物標志物的檢測是一種快速、靈敏以及準確評價污染物的方法，在海洋污染物評價方面得到廣泛的應用，在溢油污染方面也得到越來越多的應用。

1 生物標志物

生物標志物（biomarker或biological marker）是指能夠描述或表征生物機體所產生的各種變化的標志物或指標［6］。由于生物標志物具有反應靈敏、易于檢測且與污染物之間具有較強的劑量效應關系，因此可以用來反映環(huán)境污染物對生物體的作用，如可以將生物體DNA、蛋白質結構或性質、免疫系統(tǒng)或解毒系統(tǒng)的變化作為生物標志物來反映生物體受污染的程度（圖1）。

圖1 生物體對毒物暴露的反應［7］

目前，被廣泛應用于海洋污染檢測的生物標志物有DNA加合物、DNA完整性、細胞色素4501 A、金屬硫因蛋白、乙酰膽堿酯酶和抗氧化防御系統(tǒng)等（表1）。

2 生物標志物在海洋溢油污染評價中的應用

通過研究生物標志物的變化與污染物的劑量效應關系，可以揭示污染物對環(huán)境生物的致毒機理和其對生態(tài)環(huán)境的損害程度。隨著海洋溢油污染事故的頻繁發(fā)生，生物標志物逐漸成為溢油污染發(fā)生早期預警和有效監(jiān)測評價污染物的新型技術手段。目前，廣泛研究的用以溢油污染檢測和評價的生物標志物有抗氧化防御系統(tǒng)、7－乙氧基異吩惡唑－O－脫乙基酶（7－ethoxyresorufin－O－deethylase，EROD）、DNA完整性、DNA加合物和溶酶體穩(wěn)定性等（表2）。

表1 應用于海洋污染監(jiān)測的常見生物標志物類型和檢測方法［8－13］

表2 生物標志物在溢油事故污染評價中的應用［14－24］

2.1 抗氧化酶系統(tǒng)

生物體內以抗氧化酶為主體的抗氧化防御系統(tǒng)是生物抵御環(huán)境污染脅迫的重要屏障。其中還原型谷胱甘肽（glutathione sulphydryl，GSH）能夠與體內的自由基結合，以達到降低機體受外源污染產生過氧化的風險。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，Gpx）和谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S－transferases，GSTs）能夠催化體內過氧化物的還原反應。其中GSH能夠使H2O2轉化為H2O，Gpx能夠催化外源污染物與還原型谷胱甘肽相偶聯(lián)。過氧化氫酶（catalase，CAT）可以催化H2O2的還原反應，使其分解為H2O和O2，保護細胞免受過氧化物的脅迫。由于抗氧化酶與生物體對外源污染脅迫的響應有著密切的關系，因此，其活性或含量的變化可以作為評價海洋溢油污染的生物標志物。

一些學者在實驗室條件下研究了腹足綱軟體動物（Austrocochlea porcata）受原油污染脅迫后抗氧化酶系統(tǒng)的響應。受試生物暴露于含有不同濃度原油水溶性組分的海水中96小時后，暴露于25%、50%和100%原油水溶性組分海水中的受試生物體內Gpx活性顯著高于對照組，并且Gpx活性的變化與原油水溶性組分濃度的變化表現(xiàn)出顯著的正相關性［14］。對溢油現(xiàn)場的調查研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。如，一些研究者發(fā)現(xiàn)溢油現(xiàn)場不同站位采集的魚類體內GST、GR和CAT活性隨沿岸沉積物中溢油污染物濃度的增大而呈升高的趨勢［17］。學者們在對“Coral Bulker”號貨輪溢油事故海域沿岸污染情況的調查中發(fā)現(xiàn)，受試生物貽貝（Mytilus galloprovincialis）體內GSTs活性也表現(xiàn)出與上述現(xiàn)場試驗相似的結果［15］。這些研究表明抗氧化酶系統(tǒng)在抵御原油污染過程中起著重要的作用，生物體內抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化可以作為一種指示原油污染程度的生物標志物。

2.2 細胞色素P4501 A

細胞色素P4501 A（cytochrome P4501 A，CYP4501 A）在二惡英、呋喃、多氯聯(lián)苯以及多環(huán)芳香烴等污染物的生物轉化過程中起著非常重要的作用。當生長環(huán)境受到這些污染物的污染時，生物體內該酶的活性將顯著提高，從而催化生物體中異源性物質的降解［25］。

CYP4501 A的EROD活性已經在一些溢油事故現(xiàn)場的污染檢測中得到了應用。如一些研究者發(fā)現(xiàn)與未受溢油污染海域相比較，污染嚴重海域受試生物的EROD表現(xiàn)出較高的活性，但EROD活性的變化與溢油污染程度并未表現(xiàn)出的顯著的相關性［6，15，19，26］。在Exxon Valdez溢油事故發(fā)生10年后，學者們利用魚類肝部CYP4501 A的EROD作為指標對原本受污染的海域沿岸進行污染評價時發(fā)現(xiàn)，溢油污染海域受試生物CYP4501 A的EROD活性依然表現(xiàn)出顯著地高于未污染海域，表明溢油污染對該海域環(huán)境仍然具有脅迫效應［27］。也有學者在Prestige溢油事故發(fā)生5個月后利用底棲魚類（Lepido rhombus boscii和Callionymus lyra）肝部的EROD作為生物標志物檢測評價了受溢油污染海岸線的環(huán)境污染情況［28］。通過主成分分析方法發(fā)現(xiàn)采樣區(qū)域石油烴PAH組分含量與EROD的活性表現(xiàn)出一致的空間變化趨勢。此外，季節(jié)溫度的變化對EROD活性的影響并不顯著，表明可以通過檢測EROD的活性檢測評價該污染海域的溢油污染。

2.3 DNA加合物

DNA加合物是由具有毒性的環(huán)境異源物在代謝過程中與DNA的特異性位點共價結合形成的復合物。DNA加合物形成后，會導致生物體基因在復制過程中產生突變，進而產生一系列的遺傳毒性［29］。因此可以利用DNA加合物的形成作為生物體受環(huán)境毒性異源物（如石油烴類化合物）脅迫產生遺傳毒性的早期預警。

學者們通過實驗室研究和現(xiàn)場調查相結合的方法，成功應用魚類肝部細胞DNA加合物的形成量為生物標志物指示了環(huán)境中PAHs的污染狀況。研究發(fā)現(xiàn)受試生物DNA加合物的變化與環(huán)境中PAH的含量表現(xiàn)出一致的變化趨勢［30－33］。在近期開展的一項研究中，學者們利用極地鱈魚（Boreogadus saida）為受試生物，利用現(xiàn)場采樣分析和實驗研究的方法，通過檢測其肝部組織中的DNA加合物含量評價研究區(qū)域石油烴污染狀況［34］。該研究發(fā)現(xiàn)實驗室條件與現(xiàn)場分析表現(xiàn)出相似的研究結果，受試生物肝部DNA加合物含量在石油烴污染物脅迫下顯著地高于對照組，并且與石油烴污染物（2或3環(huán)PAHs）濃度的變化表現(xiàn)出顯著一致變化，表明利用鱈魚肝部組織DNA加合物的變化檢測石油烴污染物的環(huán)境損害是一種可行的方法。

2.4 溶酶體的穩(wěn)定性

溶酶體是含有多種酸性水解酶的細胞器，在生物體細胞中起著分解細胞（自噬作用）或阻止由細胞外進入細胞內物質的作用（異噬作用）［35］。軟體動物的溶酶體是多種有毒污染物的作用靶位點。在污染脅迫條件下，溶酶體結構（細胞膜穩(wěn)定性或細胞體積大?。l(fā)生顯著的改變，如由于膜的通透性增大，引起其中的水解酶活性顯著增加以及次級溶酶體（溶酶體殘體，residual bodies）的濃度也發(fā)生變化［36－39］。因此，溶酶體結構的穩(wěn)定性以及水解酶活性的變化，可以作為檢測生物體受環(huán)境污染物脅迫的生物標志物之一。

學者們在Prestige油輪溢油事故后，利用貽貝消化細胞溶酶體膜的穩(wěn)定性作為生物標志，對受污染海域的環(huán)境損害情況進行了為期一年的采樣分析［24］。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體膜穩(wěn)定性都現(xiàn)出了下降的變化趨勢。通過比較溶酶體細胞膜不穩(wěn)定間隔（labialization period，LP），發(fā)現(xiàn)貽貝樣品消化腺的溶酶體LP均為小于10 min，顯著低于正常值（20～25 min）。另外，溶酶體體積隨著其數(shù)量的減少也表現(xiàn)出顯著的增大。表明該海域溢油污染物顯著影響了溶酶體膜結構的穩(wěn)定性。作用機理可能是由于生物體自身的解毒效應，使受污染脅迫影響的溶酶體破裂，造成其數(shù)量的降低。

2.5 多種生物標志物的聯(lián)合應用

單一生物標志物雖然能夠反應對石油烴污染物對生物體產生的毒害效益，但由于污染物成分的復雜性和多樣性，使用單一生物標志物往往無法準確全面檢測和評價石油烴污染物對環(huán)境產生的毒害效應。

利用多種生物標志物對溢油污染物的響應變化評價溢油污染的環(huán)境效應已經在一些研究中得到了應用［40－41］。在近期開展的一項溢油事故環(huán)境污染評價中，學者們以魚類（Lipophrys pholis）肝部CYP4501 A的EROD和膽汁作為一組生物標志物檢測評價了目標海域的溢油污染狀況。發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，受污染海域魚類肝組織中EROD活性和膽汁中多環(huán)芳烴濃度（FAC）表現(xiàn)出一致的變化，隨著PAHs濃度的增加EROD活性顯著增加了5倍，而FAC則顯著提高了2倍，與實驗室內開展的劑量效應試驗表現(xiàn)出一致的變化趨勢［42］。

3 生物標志物技術在海洋開發(fā)與管理中的發(fā)展

3.1 技術手段和標準體系的建立

近年來，生物標志物已經被廣泛地應用于不同國家和地區(qū)的海洋環(huán)境污染的監(jiān)測中。如，全球海洋觀測系統(tǒng)沿岸海洋觀測模塊綜合戰(zhàn)略設計方案（The integrated，strategic design plan for the coastal ocean observations module of global ocean observing system，GOOS）中以生物標志物為基礎制訂了評價污染物和環(huán)境壓力的海洋污染快速評價技術（rapid assessment of marine pollution，RAMP），用以評價由污水和化學污染物排放而引起的海洋環(huán)境污染以及由于沿岸開墾、旅游和海洋產業(yè)的發(fā)展而帶來的環(huán)境壓力［43］。該設計方案在1997年巴西沿岸海域成功實施的基礎上，確定進一步評價的污染物有多環(huán)芳香烴、多氯聯(lián)苯以及有機氯等污染物。我國目前尚未建立基于生物標志物的溢油污染檢測和評價體系。因此，針對目前溢油事故頻繁發(fā)生和溢油污染日益加劇的趨勢，非常有必要建立一種有效的檢測溢油污染物和評價溢油污染環(huán)境影響的技術手段和標準體系，以服務于我國的海洋開發(fā)與管理。

3.2 基于生物標志物的傳感設備構建

生物標志物可作為傳感設備中的識別組件，利用其與污染物之間的特異反應，經信號轉換輸出從而獲得待檢測和評價污染物的目的。以此為基礎構建的生物傳感器具有快捷、特異性強和樣品用量少等優(yōu)點，目前在環(huán)境污染物的檢測和評價中已有一些應用。例如，一些研究者利用ssDNA與多環(huán)芳烴污染物之間的特異性劑量—效應關系構建了開發(fā)了ssDNA的電化學生物傳感器，并用以檢測和評價水體中的多環(huán)芳烴（PAHs）污染物［44－45］。近年來，隨著應用于石油污染物檢測評價的特異性生物標志物的篩選、信號轉換途徑和信號分析技術的不斷發(fā)展，生物傳感設備的構建將逐漸成為海上石油污染物檢測評價的有效手段之一。

4 小結

生物標志物以其能夠快速、準確檢測和評價溢油污染物的特點，已經在海洋溢油污染的評價中得到了一定的應用，為海洋溢油污染防護措施的實施和污染區(qū)域修復治理方法的選擇提供了有效的技術支持和決策依據(jù)。但由于溢油污染物的復雜性和海上環(huán)境變化的不確定性，生物標志物的應用依然面臨著一些問題去解決。

（1）由于溢油污染物往往是烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和硫化物的混合物，因此有必要在分析溢油污染物與不同生物標志物之間的劑量效應關系的基礎上，篩選能夠指示環(huán)境污染變化的特異性生物標志，提高該技術的有效性和準確性。

（2）穩(wěn)定指示海上溢油污染的生物標志物的篩選。由于海面環(huán)境的復雜性，篩選穩(wěn)定的生物標志物，使其在不同海況自然條件下，均能夠準確檢測溢油污染物的出現(xiàn)，并對其產生的環(huán)境影響進行評價，是目前海洋溢油污染評價所需要解決的問題之一。

（3）基于生物標志物的海上平臺石油污染預警系統(tǒng)的建立。利用生物標志對石油烴污染物的敏感反應，建立基于生物體早期生命響應的石油污染檢測系統(tǒng)，能夠為海上溢油污染的環(huán)境影響評價提供準確、有效的技術方法和科學依據(jù)。

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中國海洋石油總公司技術發(fā)展項目（C/KJF ETCY 002－2010）.