馬麗娟, 杜國利, 呂文魁, 曾小云, 朱 筠

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 新疆 烏魯木齊 830054)

1000-4718(2012)05-0947-04

2011-11-01

2012-03-15

新疆維吾爾自治區(qū)重點學(xué)科(內(nèi)科學(xué))資助項目

△通訊作者 Tel: 0991-4361195; E-mail:zhujun6677@163.com

氯沙坦鉀對2型糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1 表達的影響*

馬麗娟, 杜國利, 呂文魁, 曾小云, 朱 筠△

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 新疆 烏魯木齊 830054)

目的探討氯沙坦鉀對2型糖尿病腎病大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)、CD68(巨噬細胞標記物)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表達的影響，進一步說明氯沙坦鉀對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法雄性SD大鼠30只,按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組和治療組，每組10只。15周后, 觀測腎組織形態(tài)學(xué)、腎功能和24 h尿蛋白定量等指標的變化, 用免疫組化法檢測腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達水平的變化。結(jié)果(1)與正常對照組相比，模型組及治療組大鼠體重均降低，血糖、甘油三酯、膽固醇及MCP-1、CD68、TGF-β1的陽性細胞數(shù)升高，模型組24 h尿蛋白和肌酐升高；(2)與模型組相比，治療組血肌酐、24 h尿蛋白、甘油三酯及MCP-1、CD68、TGF-β1的陽性細胞數(shù)明顯降低。結(jié)論在2型糖尿病腎病大鼠中氯沙坦鉀可以通過減少腎組織MCP-1表達,阻止巨噬細胞的浸潤,下調(diào)TGF-β1表達,對糖尿病腎病病變起到保護作用。

糖尿病腎病; 氯沙坦鉀; 轉(zhuǎn)化生長因子β; CD68, 單核細胞趨化蛋白-1

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 常見和嚴重的慢性并發(fā)癥之一,糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的常見病因。目前大量研究表明免疫炎癥細胞、細胞因子、急性期反應(yīng)蛋白等炎癥介質(zhì)在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。近年來,血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blocker,ARB)腎臟保護作用受到關(guān)注,在本實驗中, 我們觀察了氯沙坦鉀對實驗性2型糖尿病腎病大鼠的保護作用,并探討其相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1動物模型的建立與分組

雄性SD大鼠30只(新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供),體重80 g左右(4～5周齡)，隨機分為正常對照組、模型組和治療組。其中模型及治療組飼以高脂高糖飼料(飼料配方：10%煉豬油，20%蔗糖，2%膽固醇，67%普通飼料、1%豬膽鹽)，正常對照組(每組10只)，飼以普通飼料。6周后模型組及治療組空腹12 h后予小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ；按30 mg/kg溶入pH 4.5的檸檬酸緩沖液)尾靜脈注射，正常對照組給予等量檸檬酸緩沖液尾靜脈注射。注射后1周測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和葡萄糖耐量實驗2 h血糖(2hPG)(葡萄糖耐量實驗：實驗前禁食12 h，空腹剪尾取血測FPG,繼以葡萄糖2 g/kg灌胃，于120 min時取血測血糖)，取FPG≥7.0 mmol/L和(或)2hPG≥11.1 mmol/L者為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠。T2DM成模的大鼠在STZ注射后分別在6周和7周時用尿微量蛋白試紙連續(xù)測大鼠晨尿3次以上，若為陽性，則為2型糖尿病腎病的大鼠，陽性者繼續(xù)測24 h尿蛋白。將成模后治療組大鼠每天給予氯沙坦鉀片20 mg/kg灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃，15周后處死并收集4～6 mL靜脈血及處死前收集24 h尿,留取雙側(cè)腎臟,稱重, 在腎皮質(zhì)處切取1 mm×1 mm×1 mm大小腎組織數(shù)塊放入2.5%戊二醛固定，其余腎臟以4%多聚甲醛固定。

2主要試劑

STZ(Sigma),氯沙坦鉀片(杭州默沙東)，尿白蛋白檢測EIA試劑盒(SPI),兔抗大鼠單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(武漢博士德生物有限公司)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)多克隆抗體(Santa Cruz)，免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉生物有限公司)。

3生化指標檢測

24 h尿白蛋白測定采用酶免疫分析法(EIA)、血糖、血肌酐、尿素氮、膽固醇、甘油三酯由全自動生化儀(法國ABX)檢測。

4免疫組織化學(xué)

采用SP法。石蠟切片常規(guī)處理,分別滴加MCP-1(1∶100)、TGF-β1(1∶100)和CD68(1∶200)Ⅰ抗,37 ℃孵化30 min,4 ℃過夜。滴加Ⅱ抗,顯微鏡下控制DAB顯色,蘇木紫復(fù)染。同時采用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。應(yīng)用北航CM-2000B 型醫(yī)學(xué)生物圖像分析系統(tǒng),進行免疫組化圖像分析,在單盲情況下每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野的腎小管-間質(zhì),以出現(xiàn)棕黃色染色為陽性信號,計數(shù)每個視野平均每0.02 mm2的陽性細胞數(shù),并求其均值。

5統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1各組腎臟一般項目及血生化比較

與正常對照組相比，模型組及治療組大鼠體重均降低(P<0.05)，血糖和膽固醇升高(P<0.01)，甘油三酯升高(P<0.05)。模型組24 h尿蛋白和肌酐升高(P<0.01)。與模型組相比，治療組肌酐和24 h尿蛋白降低(P<0.01)，甘油三酯亦降低(P<0.05)，見表1、2。

表1各組體重、腎重、血糖和24h尿蛋白定量的比較

GroupBodyweight(g)Weightofkidney(g)Bloodglucose(mmol/L)Urinaryprotein(g/24h)Normalcon-trol473.50±57.063.60±0.396.96±1.910.02±0.01Treatment431.10±54.63*4.02±0.4421.97±3.32**0.06±0.26▲▲Model404.80±63.52*3.92±0.6221.71±1.99**1.15±0.34**

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control;▲▲P<0.01vsmo-del.

表2各組甘油三酯、膽固醇、尿素氮和肌酐的比較

GroupTriglyceride(mmol/L)Cholesterol(mmol/L)Ureanitrogen(mmol/L)Creatinine(μmol/L)Normalcon-trol0.88±0.920.78±0.388.89±0.8044.20±4.64Treatment4.62±3.77*▲28.85±25.57**11.26±2.9854.11±24.68▲▲Model8.29±4.73**28.10±19.47**11.78±4.62218.40±35.73**

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsmodel.

2腎臟病理學(xué)改變

2.1腎臟光鏡改變 與正常對照組相比,模型組系膜細胞輕度到中度增生,系膜區(qū)面積占整個腎小球毛細血管襻面積增加,腎小管擴張或灶狀萎縮,并有大量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，治療組系膜細胞稍有增生，腎小管擴張不明顯，炎癥細胞浸潤少，見圖1。

2.2腎臟電鏡改變 模型組系膜內(nèi)皮腫脹，內(nèi)皮細胞空泡變性，少部分線粒體輕微腫脹。治療組內(nèi)皮細胞水腫，基底膜皺縮，系膜區(qū)有電子密度較高團塊狀結(jié)構(gòu)，足細胞內(nèi)微絲多，線粒體增多，血管腔閉塞。正常對照組腎小球結(jié)構(gòu)正常，基底膜皺縮，見圖2。

2.3各組大鼠腎臟CD68、MCP-1和TGF-β1的表達變化 CD68、MCP-1和TGF-β1均主要在腎小管-間質(zhì)胞漿表達，細胞漿呈棕黃色為陽性。模型組和治療組CD68、MCP-1和TGF-β1表達明顯高于正常對照組(P<0.01)，治療組明顯低于模型組(P<0.01)；正常對照組幾乎無表達或少表達，見圖3、表3。

Figure 1. Light microscopic performance(HE staining,×400).A: treatment group; B: model group; C: normal control group.

圖1光鏡觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化

Figure 2. Electron microscopic performance(×6 000).A: treatment group; B: model group; C: normal control group.

圖2電鏡觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變

Figure 3. Expression of CD68,MCP-1 and TGF-β1in kidney tissues(immunohistochemical staining,×400). A: treatment group; B: model group; C: normal control group.

圖3各組腎組織CD68、MCP-1和TGF-β1表達的變化

表3各組大鼠腎組織TGF-β1、MCP-1和CD68表達的變化

GroupTGF-β1MCP-1CD68Normalcontrol2.58±0.682.20±0.792.10±0.61Treatment6.64±1.35▲▲**7.40±1.34▲▲**6.64±0.70▲▲**Model16.20±2.12**15.30±2.70**17.720±1.79**

**P<0.01vsnormal control;▲▲P<0.01vsmodel.

討 論

根據(jù)美國腎數(shù)據(jù)系統(tǒng)在2010年10月公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在2008年12月底，美國晚期腎病的人數(shù)達到了547 982人的空前高度[2]，其中糖尿病腎病占了很大比例。新近研究揭示糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)的發(fā)病源于代謝紊亂和血流動力學(xué)障礙。有研究指出，炎癥及轉(zhuǎn)化因子、趨化因子的釋放會導(dǎo)致腎臟損傷[3-5]，其中MCP-1在DKD中的重要作用已成為目前研究的一個重要方向[6]。

TGF-β1是一個強力的致纖維化因子,通過促進腎小球細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分如膠原纖維連接蛋白的合成、抑制降解ECM成分的酶類合成等機制參與腎小球肥大和ECM的進行性積聚過程,最終引起腎小球硬化。Diamond等[7]利用SD大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型研究血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)對TGF-β1的刺激作用，發(fā)現(xiàn)梗阻側(cè)腎皮質(zhì)中單核巨噬細胞浸潤數(shù)目在短期內(nèi)與TGF-βmRNA表達有顯著相關(guān)性，同時腎小管上皮細胞內(nèi)MCP-1表達明顯增強。Pimentel等[8]對浸潤的單核巨噬細胞進行免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)TGF-β1免疫反應(yīng)增強，提示這些細胞也能分泌TGF-β1，促進ECM成分的積聚，有研究表明，MCP-1可通過TGF-β1介導(dǎo)實驗性腎小球腎炎膠原產(chǎn)生增加[9]。因此，DN患者小管間質(zhì)MCP-1高表達，可能是上調(diào)TGF-β1而參與小管間質(zhì)損害。Cheng等[10]亦發(fā)現(xiàn)MCP-1通過與人腎小球系膜細胞胞膜上CCR2結(jié)合,引起核因子-κB(NF-κB)激活和TGF-β1產(chǎn)生, 誘導(dǎo)纖連蛋白( fibronectin，F(xiàn)n)的mRNA和蛋白質(zhì)合成增多。

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)在慢性腎臟疾病的病理生理過程中起重要的作用。RAS系統(tǒng)過度興奮是慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展以及惡化的一個重要機制。己有研究證實，高糖狀態(tài)下，腎臟局部RAS異常活躍。AngⅡ作為RAS的最終產(chǎn)物，其生理及病理學(xué)作用均是通過與腎組織中相應(yīng)的受體結(jié)合后實現(xiàn)的。AngⅡ除影響全身和腎臟血液動力學(xué)直接參與腎損害外，還通過其非壓力依賴作用造成的腎損傷。AngⅡ作為一種生長調(diào)節(jié)因子，它能促進多種細胞因子如TGF-β1等的合成和釋放，進而刺激系膜細胞和上皮細胞肥大及增生，使ECM成分堆積，引起腎小球及腎間質(zhì)纖維化。AngⅡ不僅造成小球毛細血管高壓和小球的濾過選擇性的損害，還影響間質(zhì)的成纖維細胞和小管上皮細胞的某些功能，AngⅡ通過RAS及AngⅡ 1型受體(AngⅡ type 1 receptor,AT1)刺激腎小管細胞肥大、膠原纖維分泌，誘導(dǎo)成纖維細胞增生、膠原沉積和TGF-β1的合成，使間質(zhì)成纖維細胞、腎小管上皮細胞分化為成肌纖維細胞[11]，后期誘導(dǎo)凋亡[12]，最終引起小管間質(zhì)纖維化。

本研究建立2型糖尿病腎病模型，結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組及治療組大鼠體重均降低，血糖、甘油三酯、膽固醇及MCP-1、CD68、TGF-β1的陽性細胞數(shù)明顯升高，模型組24 h尿蛋白、肌酐升高；與模型組相比，治療組肌酐、24 h尿蛋白、甘油三酯及MCP-1、CD68、TGF-β1的陽性細胞數(shù)明顯降低。因此2型糖尿病腎病大鼠腎臟的損傷可能與MCP-1、CD68和TGF-β1相關(guān)。給予氯沙坦鉀后,與模型組大鼠相比,治療組大鼠蛋白尿明顯減少,腎損傷程度明顯減輕，而MCP-1、CD68及TGF-β1表達減少，這說明氯沙坦鉀可能通過減少MCP-1、CD68及TGF-β1表達來發(fā)揮對腎臟的保護作用。由此我們認為,在2型糖尿病腎病大鼠中氯沙坦鉀可以通過減少腎組織MCP-1表達,阻止巨噬細胞的浸潤,下調(diào)TGF-β1表達,對DN病變起到保護作用。

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InfluenceoflosartanpotassiumonrenalexpressionofTGF-β1,CD68andMCP-1intype2diabeticnephropathyrats

MA Li-juan, DU Guo-li, Lü Wen-kui, ZENG Xiao-yun, ZHU Jun

(DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urmuqi830054,China.E-mail:zhujun6677@163.com)

AIM: To observe the effects of losartan potassium on renal expression of transforming growth factor beta 1(TGF-β1), CD68 and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in type 2 diabetic nephropathy rats for exploring the protective mechanism of losartan potassium on type 2 diabetic rat kidney.METHODSThirty Sprague-Dawley rats were randomized into 3 groups: normal control group, model group and treatment group. The morphology of kidney tissues, the renal function, and the change of 24 h urinary protein quantitative index were measured after 15 weeks of treatment, while TGF-β1, CD68 and MCP-1 expression in kidney cortex was observed by immunohistochemistry.RESULTSCompared with the normal control rats, the body weight of the rats was lower in other groups, but the levels of blood glucose, triglyceride and cholesterol were higher.The expression of CD68, MCP-1 and TGF-β1, 24 h urinary protein quantitative index and serum creatinine were higher in model group than those in normal control rats. However, compared with model group, serum creatinine, 24 h urinary protein quantitative index and the expression of CD68, MCP-1 and TGF-β1were decreased in treatment group.CONCLUSIONLosartan potassium protects the kidney of diabetic nephropathy rats through inhibiting the expression of TGF-β1and MCP-1 in the kidney and restraining macrophage infiltration.

Diabetic nephropathies; Losartan potassium; Transforming growth factor beta; CD68; Monocyte chemoattractant protein-1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.034