馬 紅， 于海云， 于 燕， 曹冬青， 黃 鶯， 金惠銘， 朱依純， 盧 寧

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 徐匯 200032)

1000-4718(2012)05-0865-05

2012-01-16

2012-03-31

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81170237);博士點基金優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域課題(No.20110071130009)

△通訊作者 Tel：021-54237452 ；E-mail：luning7@shmu.edu.cn

H2S抑制Ang II引起的神經(jīng)元活性氧水平升高的機(jī)制研究*

馬 紅， 于海云， 于 燕， 曹冬青， 黃 鶯， 金惠銘， 朱依純， 盧 寧△

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 徐匯 200032)

目的探討硫化氫(H2S)對血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)所致延髓神經(jīng)元活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平變化的影響，以及H2S抗氧化應(yīng)激的相關(guān)機(jī)制。方法采用原代培養(yǎng)的延髓神經(jīng)元，分組如下：對照組、Ang II處理組、硫氫化鈉(NaHS)處理組、NaHS+Ang II處理組和PD98059(p-ERK1/2蛋白的抑制劑)+ Ang II處理組。選用二氫乙啶(DHE)熒光探針法測定各組神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平，Western blotting檢測ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量，CCK-8法測定神經(jīng)元的活性。結(jié)果Ang II(終濃度為100 nmol/L)引起神經(jīng)元ROS水平升高；NaHS(50～200 μmol/L)明顯抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平升高，但單獨給予NaHS并不影響神經(jīng)元ROS水平；p-ERK1/2蛋白的抑制劑PD98059也能明顯抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高；適宜作用濃度的NaHS能夠顯著降低Ang II引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白表達(dá)。結(jié)論H2S能夠顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平升高，其作用機(jī)制與MAPK家族中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)有關(guān)。H2S可能通過降低p-ERK1/2的表達(dá)量而產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用。

硫化氫; 血管緊張素II; 神經(jīng)元; 活性氧簇

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)與一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后，逐漸被人們所公認(rèn)的第3類氣體信號分子[1]，它是一種具有臭雞蛋氣味的無色小分子氣體，在體內(nèi)多個系統(tǒng)中廣泛存在。近年來，大量文獻(xiàn)提示H2S可增加神經(jīng)元的還原活性，具有抗氧化應(yīng)激的功能[2-3]，最終對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。本課題組已從整體動物實驗水平上提示：H2S能夠抑制自發(fā)性高血壓大鼠中樞NADPH氧化酶的活性，引起超氧陰離子等活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平減少，繼而抑制交感興奮，產(chǎn)生降低血壓和心率的心血管效應(yīng)[4]。在此基礎(chǔ)上，本工作從細(xì)胞分子水平的角度探討研究，H2S如何抵抗神經(jīng)元胞內(nèi)的高濃度ROS水平所致的氧化應(yīng)激作用。

血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)通過增加中樞神經(jīng)元胞內(nèi)ROS水平，提高神經(jīng)元的放電頻率，最終引起血壓升高，心率加快等整體效應(yīng)[5]。Ang II主要通過激活神經(jīng)元胞內(nèi)的MAPK家族這條信號通路來升高ROS水平，其中主要是超氧陰離子水平，從而產(chǎn)生一系列重要的中樞生理調(diào)節(jié)功能[6]。因此，本次實驗選用Ang II提高神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平，再給予外源性的H2S，觀察H2S能否抑制Ang II引起的神經(jīng)元高ROS水平，以及通過何種機(jī)制起作用與何種細(xì)胞信號通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1主要試劑與儀器

Ang II、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)、poly-L-lysine和二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)均購自Sigma，p-ERK1/2 抗體和ERK1/2抗體購自CST，微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)抗體與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體購自Abcam，Neurobasal medium和B27購自Gibco，CCK-8購自上海同仁化學(xué)研究所；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、BOXUN無菌超凈臺、AMG熒光倒置相差顯微鏡、TECAN酶標(biāo)儀等。

2原代培養(yǎng)及鑒定延髓神經(jīng)元

2.1原代延髓神經(jīng)元的培養(yǎng) 由上海斯萊克實驗動物中心提供的孕14～16 d 的SD大鼠，取出胎鼠，在解剖顯微鏡下剪取延髓組織[7]，選用鈍頭滴管吹打收集細(xì)胞，離心條件1 500×g離心5 min，丟棄上清，加入Neurobasal medium 與B27的混合培養(yǎng)液(比例為50∶1)，配制成細(xì)胞懸液。采用0.4 %臺盼藍(lán)對神經(jīng)元進(jìn)行染色，測定細(xì)胞活性并計數(shù)，最后接種到35 mm的培養(yǎng)皿，3 d換1次液，每次半量換液即可，培養(yǎng)8～10 d左右，神經(jīng)元已經(jīng)發(fā)育成熟，即可進(jìn)行以下實驗。

2.2原代延髓神經(jīng)元的鑒定 將已培養(yǎng)10 d的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，具體步驟如下：(1)用0.01 mol/L PBS 洗3次；(2)4 %多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；(3)0.01 mol/L PBS洗3次；(4) 5%～7 %動物血清封閉30 min；(5)分別加Ⅰ抗MAP-2抗體(1∶1 000)，GFAP抗體(1∶1 000)4 ℃過夜；(6)0.01 mol/L PBS洗3次；(7)加Ⅱ抗熒光工作液室溫避光2 h；(8)0.01 mol/L PBS洗3次；(9)DAPI染核5 min；(10)0.01 mol/L PBS洗3次；(11)熒光倒置相差顯微鏡下拍照鑒定。

3實驗分組處理

實驗共分4組，分別是：對照組、Ang II組、NaHS組、NaHS+Ang II組。此外在探討H2S作用的信號通路時分組如下：對照組、Ang II組、PD98059組、PD98059+Ang II組。

4神經(jīng)元活性的測定

將加有藥物的培養(yǎng)液吸出，加入已混勻的含CCK-8的培養(yǎng)液，CCK-8與培養(yǎng)液的體積比例為1∶10，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h左右，在酶標(biāo)儀上測定450 nm吸光度，再進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計分析。

5神經(jīng)元胞內(nèi)ROS水平的檢測

DHE熒光探針法檢測神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平，主要是超氧陰離子的水平，在去除混有藥物的培液后，用D-Hanks液洗3遍，加入5 μmol/L DHE ，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，再用D-Hanks液洗3遍，最后各孔中加入等體積的D-Hanks液，用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

6p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達(dá)水平的檢測

選用Western blotting 法測定。預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3遍，吸干后加入細(xì)胞裂解液，將刮下的蛋白移至預(yù)冷的EP管，冰上放置10 min后，沸水煮沸10 min，根據(jù)BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為35 μg，12 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，濃縮膠60 V，分離膠90 V。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加p-ERK1/2和ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜；TBST沖洗3次，每次10 min，加上HRP標(biāo)記的兔抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，再進(jìn)行顯影、定影。X光膠片采用Smart View生物電泳圖像分析軟件進(jìn)行蛋白半定量分析處理。

7統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1原代培養(yǎng)神經(jīng)元的鑒定

MAP-2是神經(jīng)元的特異標(biāo)記抗體，GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)記抗體，因Neurobasal medium與B27培養(yǎng)液中無血清，可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長，故經(jīng)過8～10 d的培養(yǎng)，最后存活的大都是神經(jīng)元，鑒定結(jié)果見圖1：在倒置顯微鏡下拍攝可見，A圖和D圖是自然光圖；B圖是用MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元(綠色)；E圖是用GFAP標(biāo)記的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，幾乎見不到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；C圖和F圖分別是神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元核的熒光雙標(biāo)圖片，其中藍(lán)色都是DAPI染的神經(jīng)元核。

Figure 1. Primarily cultured rat medullary neurons. A,D:the phase-contrast images of neurons; B,E:immunofluorescence staining of MAP-2 and GFAP, respectively;C:combined image of B and the nuclei of neurons dyed by DAPI;F:combined image of E and the nuclei of neurons dyed by DAPI. Bar=25 μm.

圖1鑒定原代培養(yǎng)的延髓神經(jīng)元

2H2S抑制AngII引起的神經(jīng)元ROS水平的升高

2.1單獨給予不同濃度NaHS對神經(jīng)元ROS水平的影響 單獨給予10～200 μmol/L NaHS處理神經(jīng)元，DHE熒光探針檢測顯示，神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平?jīng)]有明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2不同濃度NaHS對延髓神經(jīng)元ROS水平的影響

2.2H2S抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的變化 單獨給予Ang II(100 nmol/L)可明顯升高神經(jīng)元的ROS水平，且該濃度Ang II對神經(jīng)元的活性并沒有顯著影響，見圖3、4；50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L NaHS均可顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高，其中100 μmol/L NaHS作用最明顯，見圖4，故以下實驗NaHS濃度均選用100 μmol/L。

圖3CCK-8檢測AngII對神經(jīng)元活性的影響

圖4NaHS對AngII誘導(dǎo)的神經(jīng)元ROS水平的影響

3H2S顯著降低AngII引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

3.1Ang II引起神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高 單獨給予Ang II(100 nmol/L)引起神經(jīng)元的ERK1/2蛋白發(fā)生快速磷酸化，作用出現(xiàn)在給藥后5 min、10 min、15 min和30 min，但1 h后不再改變，其中5 min磷酸化的程度最高，見圖5，故以下實驗選擇5 min作為觀察p-ERK1/2蛋白的時點。

3.2H2S降低Ang II引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白表達(dá) 100 μmol/L NaHS預(yù)處理神經(jīng)元30 min 后，可顯著降低Ang II(100 nmol/L)作用于神經(jīng)元5 min時引起的p-ERK1/2蛋白的快速磷酸化表達(dá)，見圖6。

圖5AngII不同時間刺激引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白的表達(dá)變化

圖6NaHS對AngII引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3.3PD98059抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高 PD98059是p-ERK1/2的抑制劑，結(jié)果顯示，PD98059(10 μmol/L)可顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高，見圖7，從而進(jìn)一步證實了H2S抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高與p-ERK1/2蛋白有關(guān)。

圖7PD98059對AngII誘導(dǎo)的神經(jīng)元ROS水平的影響

討 論

近年來，H2S作為一種新型的氣體信號分子逐漸被人們所重視[1]。它在機(jī)體內(nèi)具有許多重要的生理保護(hù)功能，如生理濃度的H2S可以減緩急性心肌梗死所造成的心肌缺血再灌注損傷；對糖尿病腎病也有一定的保護(hù)作用；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，適宜濃度的H2S可通過提高神經(jīng)元胞內(nèi)的谷氨酰胺水平等機(jī)制來抵抗氧化應(yīng)激所造成的損傷[2-3,8-9]。

眾所周知，內(nèi)源性H2S主要由2種5’-磷酸吡哆醛依賴酶胱硫醚 β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)、胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和一種非磷酸吡哆醛依賴酶 3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MPST)催化生成[10]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的H2S主要由CBS催化生成[11]。本實驗中，我們選擇NaHS作為H2S的供體，NaHS在機(jī)體內(nèi)可解離成Na+和HS-，HS-與體液中的H+結(jié)合生成H2S，故NaHS和H2S在機(jī)體內(nèi)形成動態(tài)平衡。因NaHS可以保證培養(yǎng)液中H2S濃度的相對穩(wěn)定，所以目前為止多數(shù)文獻(xiàn)都選用NaHS作為外源性H2S的供體。

延髓是機(jī)體中重要的心血管調(diào)節(jié)中樞，本課題組的整體實驗結(jié)果顯示：H2S通過降低自發(fā)性高血壓大鼠延髓腹外側(cè)區(qū)的ROS水平而產(chǎn)生降低血壓與心率的心血管效應(yīng)[4]，那么H2S是如何降低延髓神經(jīng)元ROS水平的呢？因此本次實驗就選擇原代培養(yǎng)的延髓神經(jīng)元作為研究對象，給予一定濃度的Ang II，造成神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平一定程度的升高，再給予外源性的NaHS，觀察H2S通過何種機(jī)制及信號通路來抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高，從而保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激等毒副作用。

H2S本身就是一種還原性的氣體信號分子，具有一定的抗氧化應(yīng)激的作用，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。單獨給予神經(jīng)元一定濃度范圍的NaHS，神經(jīng)元的ROS水平?jīng)]有明顯變化，說明了H2S對神經(jīng)元有一定程度的適應(yīng)性保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示：H2S與p-ERK1/2蛋白的抑制劑PD98059都能顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高；在細(xì)胞分子水平上，100 μmol/L NaHS能夠顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元p-ERK1/2蛋白的快速磷酸化作用。

ROS是指化學(xué)性質(zhì)比較活躍的含氧原子或原子團(tuán)，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等等，內(nèi)源性ROS的來源主要包括NADPH氧化酶、過氧化物酶、細(xì)胞色素P450、黃嘌呤氧化酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等，而神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS主要由NADPH氧化酶催化生成[12]。NADPH氧化酶主要由3個胞漿亞單位(p40phox、p47phox、p67phox)和2個胞膜亞單位(gp91phox、p22phox)組成。據(jù)文獻(xiàn)報道，Ang II升高神經(jīng)元胞內(nèi)的ROS水平與NADPH氧化酶的p47phox亞單位及gp91phox亞單位激活有關(guān)[6, 13]，且H2S可以通過降低NADPH氧化酶的gp91phox亞單位的表達(dá)來減少ROS生成，從而抵抗氧化應(yīng)激[14]。在本實驗中，H2S抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高究竟與NADPH氧化酶的何種亞單位有關(guān)，它(們)與p-ERK1/2又是怎樣的上下游關(guān)系，這正是我們未來研究的重點。

綜上所述，H2S能夠顯著抑制Ang II引起的神經(jīng)元ROS水平的升高，其作用機(jī)制與MAPK家族中p-ERK1/2蛋白表達(dá)有關(guān)，H2S通過降低p-ERK1/2的表達(dá)量而產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激的作用。

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HydrogensulfidesuppressestheincreaseinreactiveoxygenspeciesinneuronsinducedbyangiotensinIIviaERK1/2signalpathway

MA Hong, YU Hai-yun, YU Yan, CAO Dong-qing, HUANG Ying, JIN Hui-ming, ZHU Yi-chun, LU Ning

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,FudanUniversityShanghaiMedicalCollege,Shanghai200032,China.E-mail:luning7@shmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on the reactive oxygen species (ROS) level in medullary neurons induced by angiotensin II (Ang II).METHODSPrimarily cultured rat medullary neurons were divided into 5 groups as follows: control group, Ang II group, sodium hydrosulfide(NaHS) group, NaHS with Ang II group, and PD98059 (an inhibitor of p-ERK1/2) with Ang II group. ROS production was measured with dihydroethidium (DHE) staining. The expression of p-ERK1/2 and ERK1/2 was determined by Western blotting. The activity of neurons was detected by CCK-8 assay.RESULTSAng II at concentration of 100 nmol/L significantly increased ROS level in the neurons, but the effect was inhibited by NaHS at concentrations of 50～200 μmol/L, while NaHS alone had no influence on the ROS level in neurons. Additionally, PD98059 also depressed the ROS level in neurons induced by Ang II. Furthermore, the enhanced expression of p-ERK1/2 in the neurons induced by Ang II was significantly reduced by NaHS.CONCLUSIONH2S remarkably inhibits the ROS level in the neurons induced by Ang II via activation of MAPK signal pathways, especially p-ERK1/2, indicating that H2S rescues neurons from oxidative stress through declining the enhanced expression of p-ERK1/2.

Hydrogen sulfide; Angiotension II; Neurons; Reactive oxygen species

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.017