王明霞， 黃建林△， 朱尚玲， 彭蔚湘， 謝寶釗， 林灼鋒， 古潔若

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東 廣州 510630；2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州 325035 )

1000-4718(2012)03-0483-05

2011-09-21

2011-11-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81072480)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.10151008901000210)

△通訊作者 黃建林 Tel:020-85252194;E-mail:jianlin_h@163.com；林灼鋒 E-mail:lzfwh@126.com

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞Sonic Hedgehog信號通路表達(dá)的初步研究*

王明霞1， 黃建林1△， 朱尚玲1， 彭蔚湘1， 謝寶釗1， 林灼鋒2△， 古潔若1

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東 廣州 510630；2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州 325035 )

目的初步探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)和滑膜組織中Sonic Hedgehog(Shh)信號通路相關(guān)因子表達(dá)及意義。方法收集符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)RA分類標(biāo)準(zhǔn)、28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(DAS28)≥3.2，病情活動RA患者(35例)及年齡、性別相匹配的健康志愿者(35例)外周血2 mL，分離PBMCs，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測Shh信號通路中信號肽Shh、膜受體Ptch1和核轉(zhuǎn)錄因子Gli1 mRNA的表達(dá)。收集10例病情中度活動(DAS28≥3.2)RA患者的滑膜組織，同時收集5例外傷或半月板損傷(無關(guān)節(jié)炎)者滑膜組織作為對照組，免疫組化檢測Shh、Ptch1和Gli1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果RA患者PBMCs中Shh和Gli1 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.36±1.48和1.15±0.68，對照組上述信號分子的mRNA表達(dá)量分別為0.47±0.25和0.49±0.05，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ptch1 mRNA表達(dá)在2組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；免疫組化示Shh和Gli1蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞百分率均高于對照組(P<0.05)，Ptch1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分率2組無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論RA患者PBMCs與滑膜組織中檢測到Shh通路相關(guān)信號分子Shh和Gli1的表達(dá)上調(diào)，提示RA患者中可能存在Shh信號通路的激活，其在RA發(fā)病機制中的作用值得進(jìn)一步研究。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕； Sonic Hedgehog通路； 單核細(xì)胞; 滑膜

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種好發(fā)于青壯年、以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。迄今為止，RA的發(fā)病機制未能完全闡明，治療方面也缺乏特別有效的方法。有研究表明成纖維樣滑膜細(xì)胞過度增殖以及滑膜血管新生是RA滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞的最主要原因[2]。在腫瘤中Sonic Hedgehog(Shh)信號通路與腫瘤血管生成密切相關(guān)[3]。Shh信號通路主要由3部分組成：Hedgehog(Hh)配體Shh、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，跨膜受體Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)及核轉(zhuǎn)錄因子腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)原癌基因家族glioma-associated oncogene-1(Gli1)、glioma-associated oncogene-2(Gli2)和glioma-associated oncogene-3(Gli3)[4-5]。其中Hh是啟動因子；Ptch是效應(yīng)細(xì)胞膜表面受體；Gli是轉(zhuǎn)錄效應(yīng)器。當(dāng)缺乏Hh時，Ptch與Smo結(jié)合并抑制Smo的活性，Gli復(fù)合物以非全長的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能；當(dāng)Hh存在時，則Hh與Ptch結(jié)合，解除了Ptch對Smo的抑制作用，激活下游的Gli轉(zhuǎn)錄因子，以全長形式轉(zhuǎn)入核內(nèi)引起靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。

Jorgensen等[7]曾推測Hedgehog 基因家族可能參與RA的發(fā)病，但是具體機制未進(jìn)一步闡明。本研究采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測了病情活動的RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中Shh信號通路中信號肽Shh、膜受體Ptch1和核轉(zhuǎn)錄因子Gli1 mRNA表達(dá)，并用免疫組化方法檢測了RA滑膜中上述信號分子的蛋白表達(dá)情況。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物，Trizol購自Invitrogen。無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷購自廣州東征公司。明膠購自Sigma，DNA marker購自北京天根生物。PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Tap Kit購自TaKaRa。免疫組化試劑：Ⅰ抗Shh(mouse IgG)抗體購自Sigma,Gil1(rabbit IgG)和Ptch1(goat IgG)抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗購自Dako。

2研究對象

收集2010年1月～2011年6月在我院門診和住院的符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)RA分類標(biāo)準(zhǔn)的病情中度活動(DAS28評分均≥3.2)的RA患者共35例，其中女性28例，男性7例，年齡26～66歲，中位年齡48歲。以健康志愿者(35名)作為對照組，其中女性27例，男性8例，年齡25～67歲，中位年齡46歲。2組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。獲得病人及志愿者的知情同意后抽靜脈血2 mL，采用肝素抗凝。

收集10例我院關(guān)節(jié)外科住院且病情中度活動(DAS28≥3.2)需行關(guān)節(jié)置換手術(shù)RA患者的滑膜組織，同時收集5例外傷或半月板損傷(無關(guān)節(jié)炎)者滑膜組織作為對照。滑膜組織用4 %多聚甲醛固定，石蠟包埋。

3方法

3.1Real-time PCR檢測信號分子的表達(dá) 肝素抗凝靜脈血2 mL，常規(guī)密度梯度離心法分離PBMCs，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計檢測標(biāo)本濃度及純度，要求A260/280在1.8～2.0，按TaKaRa兩步法試劑盒提供的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR操作。Real-time PCR檢測Shh、Ptch1和Gli1mRNA的表達(dá)。引物序列如下：(1)GAPDH正義鏈5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,反義鏈5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；(2)Shh：正義鏈5’-TCCAGAAACTCCGAGCGATTTAAG-3’，反義鏈5’- CACTCCTGGCCACTGGTTCA-3’；(3)Ptch1,正義鏈5’-CTGCGTCAGCAGAGTGATTC-3’,反義鏈5’-AGCTGAGGGTGTCCTGTGTC -3’,(4)Gli1正義鏈5’-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3’，反義鏈5’-CCGGAGTTGATGTAGCTGGT -3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環(huán)40次。融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s。反應(yīng)在ABI 7000定量熒光PCR儀上進(jìn)行，每一輪反應(yīng)均設(shè)置復(fù)孔及陰性對照。應(yīng)用比較Ct法進(jìn)行相對定量，目標(biāo)基因的相對定量用2-ΔΔCt來計算。反應(yīng)結(jié)束后取每對樣品的PCR產(chǎn)物8 μL，行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(120V、20 min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝進(jìn)行驗證。

3.2免疫組織化學(xué)檢測 石蠟包埋的組織經(jīng)脫蠟，0.3% H2O210 min 阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性。微波爐抗原熱修復(fù)處理。10%正常山羊血清室溫濕盒封閉30 min。滴加Ⅰ抗4 ℃過夜，PBS洗5 min，3次。Ⅱ抗室溫濕盒40 min。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。每項實驗都有陰性對照(缺少Ⅰ抗)，胞內(nèi)、胞膜或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。每張玻片在400倍高倍鏡下觀察5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞表達(dá)率。陽性表達(dá)率(%)= 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。評判標(biāo)準(zhǔn)如下：未見陽性細(xì)胞者為陰性(-)；< 25%為弱陽性(+)； 25% ～ 75%為中度陽性(++)；> 75%為強陽性(+++)。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1Real-timePCR檢測Shh信號分子Shh、Ptch1和Gli1mRNA在PBMCs中的表達(dá)

從表1中可見，與對照組相比，RA組的Shh mRNA和Gli1 mRNA的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Ptch1 mRNA的表達(dá)量2組之間無明顯差異(P>0.05)。同時對PCR產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳，以驗證目的基因的圖譜，見圖1，結(jié)果與real-time PCR產(chǎn)物大小相符。

2RA滑膜組織免疫組織化學(xué)結(jié)果

圖2可見Shh蛋白在滑膜組織以胞膜及胞質(zhì)均可見表達(dá)，以胞膜為主，見圖2A。Ptch1蛋白在滑膜組織以胞膜表達(dá)為主，見圖2C。Gli1蛋白在滑膜組織以胞核表達(dá)為主，見圖2E。

Figure 1. The PCR results for Shh, Ptch1 and Gli1.Lane 1, 6: marker; Lane 2, 7: Shh; Lane 4, 9: Ptch1; Lane 5, 10: Gli1; Lane 3, 8: GAPDH.

圖1PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

表1Shh、Ptch1和Gli1mRNA在PBMCs中的表達(dá)結(jié)果

GroupShhPtch1Gli1RA1.36±1.48*1.22±0.691.15±0.68*Control0.47±0.251.18±0.850.49±0.05

*P<0.05vscontrol.

Figure 2. The immunohistochemical staining of synovial tissues from RA and control groups (DAB, ×400). A, C, E and G: RA group; B, D, F and H: control group; A, B: Shh; C, D: Ptch1; E, F: Gli1; G, H: negative control.

圖2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和對照組滑膜組織的免疫組化結(jié)果

表2為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和對照組滑膜組織Shh、Ptch1和Gli1蛋白表達(dá)的半定量分析。RA組Shh和Gli1蛋白中度陽性表達(dá)率分別為80%(8/10)和20%(2/10)，明顯高于對照組的40%(2/5)和0(0/5)，P<0.05。Ptch1蛋白中度陽性表達(dá)RA組為4/10、對照組為2/5，比率均為40%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3種蛋白均未見強陽性表達(dá)。RA組表達(dá)Shh和Gli1蛋白的陽性百分率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雖然RA組Ptch1蛋白表達(dá)陽性率較對照組稍高，但差異無統(tǒng)計

學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

Shh信號通路是一個進(jìn)化保守的信號家族，首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)[8-9]，隨后又在脊椎動物中被證實。正常情況下Shh信號通路調(diào)控著胚胎期組織細(xì)胞的生長分化，胚胎發(fā)育成熟后，進(jìn)入失活狀態(tài)。近來研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中Shh信號通路存在異常激活[10-17]，而Shh通路激活后其下游血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)合成增加[18]，促進(jìn)腫瘤血管的增生。RA基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥，形成侵襲性血管翳，后者可破壞軟骨、骨與周圍組織。

表2 RA及對照組Shh、Ptch1和Gli1蛋白的表達(dá)半定量分析

*P<0.05vscontrol.

目前認(rèn)為，Shh信號通路主要由Hh配體、2個膜受體Ptch和Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli組成[19]。本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測Shh通路中的信號肽Shh，膜受體Ptch1和核轉(zhuǎn)錄因子Gli1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA組外周血PBMCs的Shh與Gli1 mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組，而Ptch1 mRNA的表達(dá)與對照組相比無明顯差異。提示Shh信號通路在活動性RA患者的PBMCs中存在基因轉(zhuǎn)錄增多激活。RA患者PBMCs細(xì)胞中是否有蛋白水平的翻譯表達(dá)尚需進(jìn)一步驗證。

本研究采用免疫組化的方法從蛋白角度檢測了Shh通路中的信號肽Shh，膜受體Ptch1和核轉(zhuǎn)錄因子Gli1在滑膜組織的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh和Ptch1蛋白在滑膜組織以細(xì)胞膜表達(dá)為主。Gli1蛋白在滑膜組織中以細(xì)胞核表達(dá)為主，其蛋白表達(dá)位置與腫瘤組織相似[20-21]。此外，本研究還顯示RA滑膜組織中Shh和Gli1蛋白中度陽性表達(dá)率均高于對照組，進(jìn)一步提示Shh信號通路在RA滑膜組織可能存在異常激活。

Hedgehog信號通路激活有幾種表現(xiàn)：配體依存性和非配體依存性。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者中配體Shh的表達(dá)在基因與蛋白水平都較正常對照組升高，提示該通路為配體依存性激活。配體表達(dá)水平改變而導(dǎo)致通路的激活可能是Sonic Hedgehog信號通路在RA的主要作用機制。

有研究[22-23]發(fā)現(xiàn)，Shh通路參與器官的急慢性損傷，在慢性肺損傷與急性腦損傷時均可引起此通路的激活。對照組5例滑膜組織亦可見蛋白的弱陽性表達(dá)，可能是由于對照組雖無明顯關(guān)節(jié)炎，但是急慢性炎癥損傷可能激活機體相應(yīng)的保護(hù)機制，從而導(dǎo)致此通路的部分表達(dá)。

總之，本實驗通過real-time PCR和免疫組化方法從基因和蛋白水平對RA患者PBMCs和滑膜組織中Shh信號通路相關(guān)分子進(jìn)行了檢測，初步證明了RA患者中可能存在Shh信號通路的激活。其在RA發(fā)病機制中所扮演的角色值得進(jìn)一步研究。

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PreliminarystudyofSonicHedgehogsignalingpathwayinrheumatoidarthritis

WANG Ming-xia1, HUANG Jian-lin1, ZHU Shang-ling1, PENG Wei-xiang1, XIE Bao-zhao1, LIN Zhuo-feng2, GU Jie-ruo1

(1DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2PharmacySchool,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China.E-mail:jianlin_h@163.com;zflwh@126.com)

AIM: To investigate the expression of Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway-associated factors in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA).METHODSThe mRNA expression levels of Shh, Ptch1 and Gli1 in PBMCs of 35 RA patients, and 35 age-and sex-matched healthy controls were analyzed by real-time PCR. The expression of Shh, Ptch1 and Gli1 in synovial tissues was detected by immunohistochemisty assay in 10 RA patients and 5 patients with traumatic or meniscal injury (no arthritis) as control group. All patients accorded with the American College of Rheumatology (ACR) 1987 revised classification criteria for determining RA, and the score of DAS28 was ≥3.2.RESULTSThe results of real-time PCR showed that the expression of Shh and Gli1 mRNA in RA patients was higher than that in the controls (Shh and Gli1 in RA were 1.36±1.48 and 1.15±0.68, while Shh and Gli1 in control group were 0.47±0.25 and 0.49±0.05, respectively). The mRNA expression of Ptch1 between the 2 groups had no significant difference. Similarly, the results of immunohistochemistry assay showed that the positive staining rates of Shh and Gli1 in RA group were higher than those in control group. However, no difference of Ptch1 positive staining rate between the 2 groups was observed (P>0.05).CONCLUSIONThe positive expression of Shh and Gli1 indicates the activation of Shh signaling pathway in the RA patients.

Arthritis, rheumatoid; Sonic Hedgehog pathway; Monocytes; Synovial membrane

R593

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.017