付 裕， 劉 紅， 周瑞瑞， 滕銀燕， 張 旭

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)03-0533-05

2011-09-13

2012-01-16

浙江省科技廳基金資助項目(No.2006C33008)

△通訊作者 Tel:0577-88841324;E-mail:drzhangxu@gmail.com

Rapsyn對正常及實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠乙酰膽堿受體的作用*

付 裕， 劉 紅， 周瑞瑞， 滕銀燕， 張 旭△

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

目的探討突觸后膜乙酰膽堿受體締合蛋白(rapsyn)對正常小鼠及實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)小鼠肌肉組織內(nèi)乙酰膽堿受體(AChR)的作用。方法將擴增的pcDNA-rapsyn質(zhì)粒注入小鼠左后肢，右后肢相同部位注射等量生理鹽水，2周后將實驗小鼠隨機分為E組和C組，E組經(jīng)腹腔注射AchR單克隆抗體35 (mAb35)誘導EAMG動物模型，C組經(jīng)腹腔注射相同劑量的生理鹽水，模型誘導48 h后處死實驗動物分離雙側后肢肌肉，注射pcDNA-rapsyn質(zhì)粒的左后肢肌肉分別為LE組和LC組，注射生理鹽水的右后肢肌肉分別為RE組和RC組。免疫熒光染色法觀察突觸后膜AChR與運動終板的結合情況，RT-PCR和Western blotting法檢測AChRα mRNA和蛋白表達情況。結果結果表明，LC組與RC組相比AChRα蛋白表達量增多(P<0.05)，LE組與RE組相比AChRα蛋白表達量增多(P<0.05)； LC組與RC組相比AChRα mRNA表達變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，LE組與RE組相比AChRα mRNA表達有明顯降低(P<0.01)。結論在肌肉組織內(nèi)上調(diào)rapsyn蛋白的表達對正常及EAMG小鼠AChR受體發(fā)揮保護性作用。

重癥肌無力，實驗性自身免疫性； 受體,乙酰膽堿； Rapsyn

重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)是由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChRAb)破壞突觸后膜運動終板上的乙酰膽堿受體(AChR)，導致AChR分子大量丟失，出現(xiàn)肌無力癥狀的自身免疫性疾病，位于神經(jīng)肌肉接頭處的N型乙酰膽堿受體(nAChR)作為自身抗原誘發(fā)了這一病理反應[1]。通過被動輸注AChRAb可建立實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasghenia gravis, EAMG)動物模型，該模型起病迅速，發(fā)病率高且易于評估，免疫病理學顯示AChR被特異性破壞,是進一步研究人類MG的理想工具。mAb35是AChR 的一種單克隆抗體，成分為大鼠IgG1，可直接作用于多種品系AChR α亞單位主要免疫區(qū)肽段，是建立EAMG被動轉移模型的理想抗體[2]。乙酰膽堿受體相關蛋白(acetylcholine receptor-associated protein at synapse，rapsyn)是一種分子量大小為43 kD的細胞骨架蛋白，對AChR起簇集和錨定作用，將AChR聚集在神經(jīng)肌肉接頭局部[3]。本實驗通過預先給小鼠體外注射表達rapsyn蛋白的質(zhì)粒，然后用被動轉移法誘導EAMG小鼠模型，通過對相應指標的評價，探討上調(diào)rapsyn蛋白的表達對正常小鼠及EAMG小鼠AChR的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 雌性C57BL/6小鼠，36只，6～8周齡，14～16 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，健康清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2主要試劑 TIB-175雜交瘤細胞(ATCC),質(zhì)粒大量抽提試劑盒、Trizol試劑(Invitrogen)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)，四甲基羅丹明標記的α銀環(huán)蛇毒(TMR-α-BTX，Sigma)，抗-rapsyn mAb 1234(Abcam)，GAPDH抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗大鼠IgG(碧云天公司)， 逆轉錄試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標準(Formentas)， DNA標準分子量(Tiangen)。

1.3主要儀器 培養(yǎng)細菌用搖床(Forma Scientific)，臺式高速離心機(Beckman)，低溫高速離心機(Eppendorf)，熒光顯微鏡(Olympus)， 超凈工作臺(蘇州安泰)，培養(yǎng)細胞用溫箱(Thermo forma)，方波刺激器(Grass)，電泳儀、PCR基因擴增儀(Bio-Rad)。

2方法

2.1質(zhì)粒的制備 將本實驗室保存的pcDNA-rapsyn質(zhì)粒轉化的保種菌液冰上復蘇，取10 μL鋪氨芐青霉素抗性的LB平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖16 h(37 ℃,250 r/min)。取100 μL過夜振搖菌液接種到300 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖16 h(37 ℃,250 r/min)擴大培養(yǎng)質(zhì)粒。按Invitrogen質(zhì)粒大量抽提試劑盒說明書抽提純化質(zhì)粒，紫外分光分度計測質(zhì)粒濃度(2 g/L)，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2抗體的制備 TIB-175雜交瘤細胞株可分泌mAb35，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清液，45%的硫酸銨鹽析，4 ℃冰箱中PBS透析過夜，制成40倍濃縮抗體，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3pcDNA-rapsyn質(zhì)粒的轉移 36只小鼠，于左后肢脛骨前肌和腓腸肌分8～10點注射pcDNA-rapsyn質(zhì)粒10 μL(2 g/L)，右后肢相應部位注射等量生理鹽水。注射5 min后用方波刺激器刺激注射部位肌肉，電壓為200 V/cm肌肉厚度，頻率1 Hz，刺激4次，每次20 ms，交換電極后以相同的頻率、強度、時間刺激。

2.4EAMG動物模型的建立及評估 質(zhì)粒轉移2周后，36只小鼠隨機分為E組和C組，每組18只，E組小鼠腹腔注射0.5 mL經(jīng)40倍濃縮雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，C組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。模型誘導后每8 h測量小鼠體質(zhì)量，并觀察動物毛色、步態(tài)及攝食情況。通過體重減低、臨床癥狀的嚴重程度及30 s抓握和懸吊實驗后肌力減低進行臨床評分：0級:無臨床癥狀，正常肌力；1級:3～5次抓握和懸吊實驗后肌力減弱，叫聲低，易疲勞；2級：頭部下垂，弓背姿勢，前爪屈曲，步態(tài)蹣跚，后肢不完全癱瘓；3級：后肢癱瘓無法站立，哭叫無聲；4級：瀕死狀態(tài)。癥狀居中間者分別評為0.5、1.5、2.5和3.5級。模型誘導48 h后處死各組實驗動物，分離雙側后肢脛骨前肌和腓腸肌，注射pcDNA-rapsyn質(zhì)粒的左后肢肌肉組織分別為LE組和LC組，注射生理鹽水的右后肢肌肉組織分別為RE組和RC組。

2.5免疫熒光染色 分離各組小鼠脛骨前肌，4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定過夜，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，做4 μm石蠟切片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，甲醇新鮮配制的0.3%H2O2中滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中煮沸15～20 min進行抗原修復，PBS洗10 min×3次，1%BSA封閉液37 ℃溫浴30 min；切片滴加Ⅰ抗anti-rapsyn mAb 1234(1∶500)4 ℃孵育過夜，含0.3%Triton X-100的PBS振蕩洗滌10 min×3次，滴加TMR標記α-BTX(10 mg/L)，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG(1∶200)，37 ℃孵育1 h，PBS洗10 min×3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.6RT-PCR Trizol試劑提取各組肌肉組織總RNA，紫外分光光度計定量后，取2 μg RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。設計和合成引物：應用Primer 5.0軟件分別設計上、下游引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。AChRα上游引物5’-CCTCCACCTATGGGCTTTC-3’，下游引物5’-TCCTCAGCGGCGTTATTG-3’，產(chǎn)物長度125 bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-GGTGAAGGTCGGTGAACG-3’，下游引物5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’，產(chǎn)物長度233 bp。 PCR擴增循環(huán)條件：先94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(AChRα退火溫度為53 ℃，GAPDH退火溫度為56 ℃)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min，4 ℃保持。取PCR擴增產(chǎn)物各5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析各條帶吸光度值，以同一標本擴增的GAPDH為內(nèi)參照，測定PCR產(chǎn)物條帶和GAPDH內(nèi)參照條帶的密度比值作為目的基因相對表達量。

2.7Western blotting 取各組肌肉組織，液氮研磨，加入冰預冷蛋白裂解液勻漿，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，取100 μg總蛋白變性，120 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒濕法電轉移55 min至0.2 μm PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液作為Ⅰ抗4 ℃搖床過夜，TBST洗膜10 min×3次，Ⅱ抗為HRP標記山羊抗大鼠IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL顯色液顯色5 min，暗室中曝光、顯影和定影。Quantity One 軟件分析各條帶光密度值，GAPDH(1∶1 000)作為內(nèi)參照蛋白，結果以目的條帶光密度與同一標本GAPDH蛋白光密度比值表示。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1EAMG模型的評估

E組小鼠于注射mAb35 8 h后表現(xiàn)為精神差和活動減少，48 h 時有13只小鼠出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，疲勞、低頭、弓背姿勢、活動后無力等，5只小鼠無任何臨床癥狀；C組小鼠無一只出現(xiàn)任何臨床癥狀，兩組小鼠臨床評分見圖1。

圖1mAb35或生理鹽水誘導后C57BL/6小鼠的臨床評分變化

2免疫熒光染色結果

RE組與RC組相比，AChR和rapsyn在骨骼肌的運動終板處熒光著色均減少；LC組與RC組相比，AChR和rapsyn熒光著色均增多；LE組與RE組相比，AChR和rapsyn熒光著色均增多，其表達量接近RC組，見圖2。

3RT-PCR基因擴增結果

AChRα電泳結果顯示擴增片段為125 bp，GAPDH為233 bp，與預期設計的目的片段大小相同，見圖3。與RC組相比，RE組和LE組AChRα mRNA的表達量明顯增多(P<0.01)；LE組與RE組相比，AChRα mRNA表達量明顯減少(P<0.01)； LC組與RC組相比，AChRα mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

Figure 2. Immunofluorescent staining detection of AChR and rapsyn expression at the mouse muscle endplate(×400). Paraffin sections of tibialis anterior muscles were double-stained with TMR-conjugated α-BTX(left) and anti-rapsyn mAb1234(middle).The merged images are on the right.RC:right hind limb muscles in control group;RE:right hind limb muscles in experimental group;LC:left hind limb muscles in control group;LE:left hind limb muscles in experimental group.

圖2免疫熒光染色分析AChR和rapsyn在運動終板處的表達

Figure 3. The expression of AChRα mRNA determined by RT-PCR.

圖3AChRαmRNA的表達

表1AChRαmRNA和蛋白檢測結果的定量分析

GroupmRNA(AAChRα/AGAPDH)Protein(AAChRα/AGAPDH)RC0.122±0.0130.135±0.038RE0.333±0.049**0.079±0.035*LC0.119±0.0110.175±0.029*LE0.211±0.035**△△0.117±0.012*△

*P<0.05,**P<0.01vsRC group;△P<0.05,△△P<0.01vsRE group.

4Westernblotting蛋白表達結果

小鼠AChRα蛋白分子量為28 kD，內(nèi)參照GAPDH蛋白為36 kD,見圖4。與RC組相比，RE組和LE組AChRα蛋白表達水平均降低(P<0.05)；LC組與RC組相比，AChRα蛋白表達水平升高；LE組與RE組相比，AChRα蛋白表達水平升高(P<0.05)，見表1。

Figure 4. The expression of AChRα protein determined by Western blotting.

圖4AChRα蛋白的表達

討 論

nAChR是穿過膜脂質(zhì)雙分子層的糖蛋白多聚體，是集受體與通道于一個大蛋白分子內(nèi)的遞質(zhì)門控通道的一種[4]。nAChR由4類共5個亞基構成(α2βγδ)，α亞基約占nAChR分子的40%，在功能上起著決定性作用。α亞基上不但有膽堿能配體結合部位，AChRab的主要結合靶點也位于α亞基上的主要免疫原區(qū)第67～76位氨基酸殘基上，βγδ為結構性亞單位[5]。

Rapsyn主要由肌肉組織合成，是一種分子量大小為43 kD的細胞骨架蛋白，對AChR起簇集和錨定作用。在神經(jīng)肌肉接頭形成以前，AChRβ亞基和rapsyn以1∶1自發(fā)相連，成簇散布于肌細胞膜表面，當神經(jīng)軸突與肌膜接觸的瞬間，軸突釋放神經(jīng)源性信號分子(agrin)結合并激活突觸后膜的肌肉特異性酪氨酸激酶(MuSK)，進一步激活下游轉導通路，通過rapsyn相關跨膜配體連接蛋白(rapsyn-associated transmenbrane ligand，RATL)與 rapsyn相連接，將AChR聚集在神經(jīng)肌肉接頭局部[6]。

本實驗將pcDNA-rapsyn質(zhì)粒通過方波刺激導入實驗小鼠的左后肢，2周后被動輸注mAb35建立EAMG小鼠模型。通過熒光雙標染色顯示EAMG小鼠rapsyn和AChR蛋白含量減少，Western blotting檢測結果發(fā)現(xiàn)，EAMG小鼠AChRA蛋白含量明顯較少(P<0.05) 。MG的主要病理損害在突觸后膜，體液免疫和細胞免疫均參與MG的發(fā)病過程，AChRAb是主要的致病抗體[7]，依賴抗體的補體溶解作用使rapsyn和AChR分子被大量破壞，同時抗體介導的抗原調(diào)變作用也加速了AChR分子的內(nèi)化和溶酶體的降解作用，使乙酰膽堿受體分子的半衰期由7 d降至2 d，使體內(nèi)神經(jīng)肌肉突觸后膜上功能性AChR分子的數(shù)量急劇減少[8]。經(jīng)rapsyn預處理的EAMG小鼠AChR蛋白含量增加(P<0.05)，說明上調(diào)rapsyn的表達減少了EAMG小鼠AChR的損失， 對AChR發(fā)揮保護性作用。經(jīng)rapsyn預處理的正常小鼠AChR蛋白的表達量也有增加(P<0.05)，說明上調(diào)rapsyn的表達能穩(wěn)定未在突觸后膜聚集的AChR，或能穩(wěn)定AChR在體內(nèi)的代謝。有實驗證明小鼠rapsyn基因剔除后AChR集聚受阻，出現(xiàn)突觸形成障礙[9]，且rapsyn在突觸后膜的表達量不同，建立EAMG動物模型的易感性也不同[10]。

Sheng等[11]研究表明，EAMG小鼠的骨骼肌中AChR α亞基的mRNA表達量是增加的，在病情嚴重的小鼠中表達量更高，AChR功能蛋白丟失越多，mRNA表達越多并且疾病越嚴重。這可能是因為功能性AChR蛋白的丟失致使AChRα mRNA表達代償性增加引起的。EAMG小鼠AChRα mRNA表達量增加，但AChRα蛋白表達并未增加的原因可能是由于補體介導的突觸后膜溶解使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構受損，AChRα蛋白裝配障礙，或是蛋白翻譯過程異常造成的。本實驗RT-PCR結果顯示，經(jīng)rapsyn預處理的EAMG小鼠AChRα mRNA的表達量明顯降低(P<0.01)，說明上調(diào)rapsyn表達抑制了突觸后膜的溶解，減輕了肌肉組織受損的嚴重程度，減少了突觸后膜AChR功能蛋白的丟失。經(jīng)rapsyn預處理的正常小鼠與未經(jīng)處理的正常小鼠相比，AChRα mRNA的表達量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明AChRα基因的表達是非rapsyn基因依賴性的，兩者的基因表達是相互獨立的過程。

綜上所述，在肌肉組織內(nèi)，上調(diào)rapsyn蛋白表達可以增加正常小鼠AChR蛋白的含量， 減少EAMG小鼠AChR蛋白的損失量， 減低EAMG小鼠由于AChR蛋白減少而代償性增加的AChR mRNA表達量，對AChR受體發(fā)揮保護性作用。未來的研究方向是如何通過其它方法上調(diào)肌肉組織中rapsyn蛋白表達，發(fā)揮預防和治療重癥肌無力的作用。

[1] Hoedemaekers A, Graus Y, van Breda Vriesman P, et al. Age- and sex-related resistance to chronic experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) in Brown Norway rats[J]. Clin Exp Immunol, 1997,107(1): 189-197.

[2] Poulas K, Tsouloufis T, Tzartos SJ.Treatment of passively transferred experimental autoimmune myasthenia gravis using papain[J].Clin Exp Immunol, 2000,120(2): 363-368.

[3] Frail DE, Mclaughlin LL, Mudd J, et al. Identification of the mouse muscle 43 000-delton acetylcholine receptor-associated protein (RAPsyn) by cDNA cloning[J]. J Biol Chem, 1988, 263(30): 15602-15607.

[4] McNerney ME, Pardi D, Pugh PC, et al. Expression and channel properties of α-bungarotoxin-sensitive acetylcholine receptors on chick ciliary and choroid neurons[J]. J Neurophysiol, 2000, 84(3): 1314-1329.

[5] Graus YM, van Breda Vriesman PJ, de Baets MH. Characterization of anti-acetylcholine receptor (AChR) antibodies from mice differing in susceptibility for experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG)[J]. Clin Exp Immunol, 1993, 92(3): 506-513.

[6] Bruneau E, Akaaboune M. The dynamics of the rapsyn scaffolding protein at individual acetylcholine receptor clusters[J]. J Biol Chem, 2007, 282(13): 9932-9940.

[7] 賴詳青, 楊明山, 徐金枝, 等. 重癥肌無力患者免疫發(fā)病機理的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2001,17(7):662-664.

[8] Luo J, Kuryatov A, Lindstrom JM. Specific immunotherapy of experimental myasthenia gravis by a novel mechanism[J]. Ann Neurol, 2010, 67(4): 441-451.

[9] Gautam M, Noakes PG, Mudd J, et al. Failure of postsynaptic specialization to develop at neuromuscular junctions of rapsyn-deficient mice[J]. Nature, 1995, 377(6546): 232-236.

[10]Losen M, Stassen MH, Martínez-Martínez P, et al. Increased expression of rapsyn in muscles prevents acetylcholine receptor loss in experimental autoimmune myasthenia gravis[J]. Brain,2005, 128(10): 2327-2337.

[11]Sheng JR, Li LC, Prabhakar BS, et al. Acetylcholine receptor-α subunit expression in myasthenia gravis: a role for the autoantigen in pathogenesis?[J].Muscle Nerve, 2009, 40(2): 279-286.

Effectofrapsynonacetylcholinereceptorinnormalandexperimentalautoimmunemyastheniagravismice

FU Yu, LIU Hong, ZHOU Rui-rui, TENG Yin-yan, ZHANG Xu

(DeparmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:drzhangxu@gmail.com)

AIM: To investigate the effect of acetylcholine receptor-associated protein at synapse (rapsyn) on acetylcholine receptor (AChR) in normal mice and mice with experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG).METHODSThe left hind limb of each mouse was injected with pcDNA-rapsyn at 8～10 sites equally spread over the muscle, and the right hind limb was injected with the same volume of 0.9% NaCl. Two weeks after electropermeabilization, 36 mice were divided into 2 groups: the mice in group E were intraperitoneally injected with 0.5 mL 40-fold concentrated cell culture supernatant of mAb35, and the mice in group C were intraperitoneally injected with the same volume of 0.9% NaCl. The animals were killed 48 h after injection. The tibialis anterior muscles and calf muscles of bilateral hind limbs were isolated.The muscles of left hind limb

rapsyn plasmid were LE group and LC group, and the muscles of right hind limb muscles pcDNA-received 0.9% NaCl were RE group and RC group. The expression of AChR and rapsyn at the mouse muscle endplate was detected by immunofluorescence staining. The expression of AChRα at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blotting,respectively.RESULTSThe protein expression of AChRα was higher in LC group than that in RC group (P<0.05). The protein expression of AChRα was higher in LE group than that in RE group (P<0.05). No statistical difference of the AChRα mRNA expression between LC group and RC group was observed (P> 0.05). The mRNA expression of AChRα was significantly lower in LE group than that in RE group (P<0.01).CONCLUSIONProtein overexpression of rapsyn by plasmid transfection protects the AChRs in the muscles of both nomal and EAMG mice.

Myasthenia gravis,experimental autoimmune; Receptors,acetylcholine; Rapsyn

R746.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.026